本课题来自陕西省重点研发计划项目“经典名方芍药甘草汤的质量标志物研究及其应用”（编号:2019SF-300）。神经病理性疼痛是由躯体感觉神经系统疾病或神经损伤引起的疼痛。持续时间长且难以根治,严重影响患者的生活质量。芍药甘草汤始载于《伤寒杂病论》,由白芍和炙甘草两味中药组成,是解痉止痛经典方剂,在临床上用于治疗神经病理性疼痛等难治性疼痛,不良反应少、疗效确切。不少学者对芍药甘草汤开展化学成分分析与药理药效研究,但关于其治疗神经病理性疼痛的物质基础与作用机制仍未得到很好的阐释,影响了芍药甘草汤的临床有效应用及进一步的药物开发。因此,亟需应用现代科技方法,揭示芍药甘草汤治疗神经病理性疼痛的药效物质基础与相关机制。本文主要从芍药甘草汤的药效物质基础与作用机制、芍药甘草汤成分配伍作用以及芍药甘草汤的质量标志物三个方面开展研究,为芍药甘草汤的临床精准应用提供科学依据,也为芍药甘草汤的进一步药物开发奠定基础。本论文共分为四章,各章的研究内容及结果如下:第一章文献研究第一节芍药-甘草药对的中医应用数据分析本节应用关键词映射法对芍药、甘草在中医方剂中的配伍应用信息进行统计,采用频数统计及网络图对芍药、甘草的应用信息进行数据挖掘,结果发现,芍药和甘草常用剂量均为31.25 g和15.53 g,常用配伍比例为1:1,占总数的37.06%;芍药-甘草常用配伍药为当归、川芎、人参、茯苓、地黄,占总数的16.63%;常用制法用法为水煎、生用内服、酒煎、外用、水酒共煎、膏煎、醋煎;方剂功效以止痛、补虚、解毒、祛风、消肿、明目为主,科属以内科、外科、妇科、儿科、五官科为主。且用药量、配伍比例和制法用法与功效、科属间存在相关关系,芍药-甘草最常用于内科、外科,两药合用量以62.50 g频次最高,功效以止痛最为常见;配伍比例1:1频次最高,常用于止痛、解毒、祛风;制法为水煎频次最高,常用于止痛、解毒、补虚等。第二节本课题的研究思路与论文设计本节旨在说明课题研究思路、论文设计及研究内容的整体框架。围绕经典名方芍药甘草汤,以神经病理性疼痛为疾病模型,拟解决以下关键问题:（1）阐明芍药甘草汤的功效物质基础;（2）揭示芍药甘草汤的作用机制;（3）明确芍药甘草汤的质量标志物。最终为芍药甘草汤质量标准建立提供科学依据,为经典名方的质量控制提供思路与方法的探索。第二章芍药甘草汤止痛药效物质基础与作用机制研究第一节芍药甘草汤止痛的药效研究本节采用坐骨神经分支选择性损伤（SNI）建立大鼠神经病理性疼痛模型,给以普瑞巴林作为阳性药物,给以芍药甘草汤低、中、高剂量进行治疗,以大鼠机械痛阈值和生化指标考察芍药甘草汤对神经病理性疼痛大鼠的作用。通过研究发现,SNI模型导致大鼠机械痛阈值降低,并且调节了疼痛相关指标,通过给药芍药甘草汤后,发现芍药甘草汤的三个剂量组均可以回调机械痛阈值及各生化指标,且以中剂量组（即人的临床等效剂量）的改善效果最好。第二节基于代谢组学的芍药甘草汤止痛作用机制研究本节基于UPLC-Q-TOF/MS的代谢组学方法研究芍药甘草汤对SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠止痛的作用机制,结果从假手术组和SNI组之间共鉴定出128个差异代谢物（84个来自负离子模式,44个来自正离子模式）,在此基础上,从芍药甘草汤组和SNI组中共鉴定出40个差异代谢物并确定为潜在生物标志物（22个来自负离子模式,18个来自正离子模式）,并构建了芍药甘草汤治疗神经病理性疼痛的5条相关代谢途径,即甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚生物合成和花生四烯酸代谢。给予芍药甘草汤后能够回调神经病理性疼痛模型导致的大鼠内源性生物标志物的变化,表明芍药甘草汤可能通过调节上述通路从而达到治疗神经病理性疼痛的作用。得到的代谢通路也为后期进一步阐明芍药甘草汤治疗神经病理性疼痛的潜在靶点提供参考。第三节基于多指标综合指数法与PLSR整合策略的芍药甘草汤止痛药效物质基础研究本节通过UPLC-Q-TOF/MS技术获取芍药甘草汤给药后的入血成分,并采用皮尔逊相关分析法进行成分与基于代谢组学鉴定的生物标志物相关性分析。采用多指标综合指数法与PLSR相结合的方法,揭示各成分对疗效的贡献,最终找到芍药甘草汤治疗神经病理性疼痛的活性成分,进而阐释芍药甘草汤止痛的药效物质基础。结果表明,芍药甘草汤中有44种成分为入血成分,采用皮尔逊相关分析法发现了14种止痛成分,采用多指标综合指数法与PLSR整合策略法,筛选出丹皮酚、苯甲酸、欧甘草素A和Paeonilactone C等可能为芍药甘草汤治疗神经性疼痛的药效成分。第三章芍药甘草汤成分配伍的作用及机制研究第一节芍药苷-甘草苷止痛的作用评价本节选择芍药甘草汤的代表性成分芍药苷和甘草苷联合用药来评价其止痛作用。建立坐骨神经分支选择性损伤（SNI）模型,设立假手术组、SNI模型组、芍药苷-甘草苷低、中、高剂量组、阳性药普瑞巴林组,以大鼠的机械痛阈值作为检测指标,考察芍药苷-甘草苷联合用药对神经病理性疼痛大鼠的作用。结果发现,SNI模型导致大鼠机械痛阈值降低,通过给药芍药苷-甘草苷后,发现其三个剂量组均可以显著升高大鼠的机械痛阈值,且以中剂量组的改善效果最好。第二节基于脂质组学的芍药苷-甘草苷止痛作用机制研究本节基于脂质组学研究芍药苷-甘草苷对SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠止痛的作用机制,结果表明,通过VIP>1和P<0.05从血浆样本中筛选出18个差异代谢物,包括9个磷脂酰胆碱,5个甘油三酯,3个溶血磷脂酰胆碱,1个胆碱乙醇胺;通过VIP>1和P<0.05从脊髓组织共筛选出5个差异代谢物,包括2个磷脂酰胆碱,1个溶血磷脂酰胆碱,1个溶血磷脂酰乙醇胺,1个神经酰胺。给予芍药苷-甘草苷后能够回调神经病理性疼痛模型导致的大鼠差异代谢物的变化。由这些差异代谢物获得甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、甘油脂代谢、类固醇生物合成、鞘脂代谢和花生四烯酸代谢等通路,说明芍药苷-甘草苷可能通过调节上述通路达到治疗神经病理性疼痛的作用。第三节基于转录组学的芍药苷-甘草苷止痛作用机制研究本节通过转录组学技术对假手术组、SNI模型组、芍药苷-甘草苷中剂量组的大鼠L3-L6脊髓组织进行高通量测序,筛选SNI模型组与芍药苷-甘草苷联合用药作用的差异表达基因,随后对差异表达基因进行聚类分析、GO分析和KEGG通路富集分析。研究结果表明,SNI模型组与芍药苷-甘草苷中剂量组共有342个差异表达基因,其中显著上调的基因有64个,显著下调的基因有278个。这些差异表达基因经富集主要与c AMP信号通路、钙离子信号通路、PPAR信号通路、醚脂代谢、α-亚麻酸代谢、甘油磷脂代谢等通路有关。初步阐明了芍药苷-甘草苷对神经病理性疼痛的治疗作用机制,为芍药苷-甘草苷治疗神经病理性疼痛提供了科学依据。第四节基于脂质组学和转录组学的芍药苷-甘草苷止痛作用联合分析及作用机制研究本节采用脂质组学与转录组学联合分析的方法,探讨芍药苷和甘草苷合用治疗神经病理性疼痛的作用机制,并采用q RT-PCR进一步验证各通路对应基因的变化。结果发现,有7条通路中的代谢物与差异基因之间有较强的关联性,分别是甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、甘油脂代谢、鞘脂代谢、花生四烯酸代谢和类固醇生物合成。通过q RT-PCR技术进一步验证上述甘油磷脂代谢中PLC-IP3R-PKC-CREB通路中对应基因的变化,证明了给予芍药苷-甘草苷后能够回调SNI导致的大鼠体内差异表达基因的变化,即芍药苷-甘草苷可能通过调节PLC-IP3R-PKC-CREB通路从而达到治疗神经病理性疼痛的作用。第四章芍药甘草汤质量标志物的量化辨识与量值传递第一节芍药甘草汤质量标志物的量化辨识本节为研究芍药甘草汤的质量标志物,构建了一个中药质量标志综合评判指标体系。首先采用层次分析法对一级指标有效性、可测性和特有性进行权重分析,其次在各一级指标下应用熵权法对有文献及实验数据支撑的二级指标进行分析,计算指标层各因素的权重后加权计算各成分的综合得分并排序得到芍药甘草汤的质量标志物。结果显示,芍药甘草汤的一级指标有效性权重为59%,可测性为31%,特有性为10%;有效性的二级指标文献数和实验数据分别占67.60%和32.40%,可测性的二级指标测定文献数、HPLC占比、药材含量均值、药材含量变异性、药材-方剂转移率的权重分别为18.90%、14.17%、27.58%、14.48%和24.88%;特有性的二级指标存在植物数权重为100%。综合评分后,分值排名靠前的10个成分为:芍药苷>槲皮素>芍药内酯苷>甘草酸>柚皮素>甘草苷>氧化芍药苷>苯甲酰芍药苷>甘草素>异甘草素,这些成分可初步确定为芍药甘草汤止痛作用的质量标志物。第二节芍药甘草汤质量标志物的量值传递本节采用高效液相色谱法开展了芍药甘草汤的药材-饮片-物质基准的量值传递研究,通过出膏率、含量测定和指纹图谱等确保了物质基准的批间质量一致性及可追溯性。结果显示,药材-饮片、饮片-物质基准中没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、苯甲酸、异甘草苷、槲皮素、苯甲酰芍药苷和甘草酸的转移率数据波动范围在平均值的70%～130%以内,均未出现离散数据。芍药苷、槲皮素、芍药内酯苷、甘草酸、柚皮素、甘草苷、氧化芍药苷和苯甲酰芍药苷在药材、饮片和物质基准中均可测得,最终将以上成分确认为芍药甘草汤的质量标志物。