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本文是2000年度吉林省科技厅科研课题“哈蟆油质量评价及开发研究”的一个主要内容，是为哈蟆油建立合理的、科学的质量评价而进行的基础研究。
2000～2003年，翁丽丽老师在硕士期间采用硅胶湿柱层析分离方法对石油醚提取物(膏A)及乙醇提取物(膏C)进行提取、分离，并从中分离出5个单体化合物，鉴定了其中的两个为胆甾醇和1-甲基-2，4-咪唑二酮。另外三个化合物初步鉴定为胆甾-4，6-二烯-3-醇、十六烷酰胺、胆甾-3，5，6-三醇。本文以翁老师研究为基础，继续针对哈蟆油中石油醚提取物(膏A)部分有价值的流份进行进一步分离、纯化。
首先，利用薄层色谱法检查，将主斑点相同的流份合并，然后采用硅胶湿柱层析分离方法对脂溶性成分进行分离，共收集到480余个流份，斑点相同者合并，经合并后共得到11组流份。对第2组流份进行进一步柱层析分离，得到无色液体状物质，经GC-MS鉴定为十四碳酸乙酯、十五碳酸乙酯、十六碳酸乙酯、9-烯-十六碳酸乙酯、9-烯-十八碳酸乙酯。在第4组流份中经重结晶得一白色鳞片状结晶命名为化合物B，经薄层色谱检识及气-质联用分析鉴定为十六碳酸。在第8～10组流份中分离得到一甾体混合物，经GC-MS分析后，鉴定为4种甾体化合物，分别是胆甾-5-烯-3-醇-7-酮、胆甾-5，7-二烯-3-醇、胆甾-4，6-二烯-3-醇、胆甾-3-烯-2-甲基。在第1组流份中经重结晶得到一个单体化合物命名为化合物A，经MS、NMR、IR光谱等鉴定为十六烷酸胆甾醇酯。此外，又以自制的十六烷酸胆甾醇酯作为对照品，通过HPLC法对哈蟆油样品进行了含量测定和方法学研究。测定方法采用Sil色谱柱，流动相为环己烷：乙醚(40：1)；检测波长为203nm；柱温40℃；流速1ml/min。结果表明十六烷酸胆甾醇酯在0.595～8.925ug范围内具有良好的线性关系，平均回收率为98.3％，RSD为1.40％，具较好的精密度、重现性及稳定性。