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研究目的:研究脓毒症引发的中枢神经系统炎症中,Mac-1-NOX2信号通路对小胶质细胞（中枢神经系统中的巨噬细胞）的急性和慢性激活以及促炎症因子表达的影响和作用机制,为治疗和预防脓毒症引发的中枢神经系统炎症及其相关损害提供理论和实验依据。内容:建立小鼠脓毒症引发的中枢神经系统炎症模型,体内实验中检测LPS对小胶质细胞的形态学变化和小鼠脑中TNF-α、IL-1b等炎症因子m RNA的水平。通过体外实验研究Mac-1-NOX2信号通路对小胶质细胞Iba-1表达的影响的作用机制。方法:1.建立小鼠脓毒症引发的中枢神经系统炎症模型:分别对C57BL/6J小鼠及其相应种系的Mac-1 KO（Mac-1受体敲除）小鼠进行5 mg/kg LPS腹腔注射,并分别设立生理盐水腹腔注射对照组。2.在注射LPS后1天和7天,采用免疫组化方法对各组小鼠大脑的冰冻切片进行Iba1染色,观察小胶质细胞的形态学变化。3.在注射LPS后1小时和7天,采用实时定量RT-PCR方法检测各组小鼠大脑中TNF-α,IL-1β,COX2和MCP-1等炎症因子m RNA的表达水平。4.制备C57BL/6J小鼠和Mac-1KO小鼠的神经元-胶质细胞原代培养,用LPS处理并设置对照组。通过Western Blot检测小胶质细胞标志物Iba-1蛋白的表达水平在LPS处理后0天,1天,2天,3天,5天的变化。5.制备C57BL/6J小鼠和NOX2-/-小鼠的神经元-胶质细胞原代培养,用LPS处理并设置对照组。通过Western Blot检测小胶质细胞标志物Iba-1蛋白的表达水平在LPS处理后0天,1天,2天,3天,5天的变化。6.制备C57BL/6J小鼠和Mac-1KO小鼠的小胶质细胞富集培养,使用免疫荧光染色方法观察小胶质细胞经LPS处理1小时后,NOX2的细胞内部亚基P47phox移位情况。结果:1.注射生理盐水的C57BL/6J小鼠和Mac-1 KO组小鼠大脑的小胶质细胞呈现静息状态,其形态表现为分枝状,胞体较小,突起形态细长,未有明显活化现象;两组小鼠经腹腔注射LPS后1天小胶质细胞表现为杆状、粗大分枝状或胞体呈串珠或球状改变,胞体变大,突触缩短,数量明显增多,均出现明显激活的现象,但是两组之间在细胞形态上并没有明显的差别。然而,LPS处理后7天,两组小胶质细胞活化程度出现较为明显差异,C57BL/6J小鼠的小胶质细胞细胞激活状态仍在持续,而Mac-1 KO组小鼠的小胶质细胞则恢复至静息状态。2.腹腔注射LPS之后1小时C57BL/6J与Mac-1 KO组小鼠脑部的TNF-α,IL-1β,COX2,MCP-1 m RNA表达相较于各自的生理盐水对照组小鼠有显著的上升（均p<0.001）,而两实验组小鼠之间并未见明显差异（P>0.05）。在LPS处理后7天,两实验组小鼠大脑组织中促炎症因子的m RNA水平较LPS注射后1小时均有大幅度的下降（均p<0.001）,但是C57BL/6J组小鼠脑中的促炎症因子m RNA表达仍然保持低度增加,不能恢复到正常水平,与生理盐水对照组小鼠有明显差异（P<0.001）,然而Mac-1 KO小鼠脑中促炎因子的m RNA表达已恢复到正常水平,与生理盐水对照组无统计学差异。3.经LPS处理后,C57BL/6J和Mac-1 KO组神经元-胶质细胞在0、1、2、3、5天,小胶质细胞Iba-1蛋白表达量逐渐增多,在第5天最多。C57BL/6J与Mac-1KO组细胞培养中小胶质细胞Iba-1表达量相比,在LPS处理后1天至2天增加量无明显差异,但在LPS处理后第3天Mac-1组Iba-1表达量明显少于C57BL/6J组（P<0.05）,这种差异在LPS处理后第5天更为明显（P<0.01）。4.经LPS处理后,C57BL/6J(NOX2+/+)和NOX-2-/-组神经元-胶质细胞在0、1、2、3、5,小胶质细胞Iba-1蛋白表达量逐渐增多,在第5天最多。C57BL/6J与NOX-2-/-组细胞培养中小胶质细胞Iba-1表达量相比,在LPS处理后1天至2天增加量无明显差异,但在LPS处理后第3天NOX-2-/-组Iba-1表达量明显少于C57BL/6J组（P<0.05）,这种差异在LPS处理后第5天更为明显。5.在小胶质细胞静息状态,NOX2的P47phox亚基散布在细胞质当中,经过LPS处理1小时后,共聚焦显微镜显示C57BL/6J小鼠的小胶质细胞上呈现清晰的环状荧光染色,提示P47phox位移到细胞膜,而Mac-1 KO组小鼠的小胶质细胞则观察不到环状荧光染色,提示没有明显的P47phox位移。结论:1.脓毒症小鼠可以引起小胶质细胞发生活化和促炎症因子增多,形成中枢神经系统炎症。2.Mac-1参与脓毒症引起的神经慢性炎症中小胶质细胞活化和促炎症因子表达的维持。3.NOX2参与脓毒症引起的神经系统炎症中小胶质细胞活化的维持。4.NOX2的细胞亚基P47phox在Mac-1受体存在的情况下,通过位移至细胞膜的方式共同参与神经炎症中小胶质细胞的持续活化。5.Mac-1-NOX2信号通道是脓毒症引发的神经炎症中小胶质细胞持续激活机制中重要的一部分,可作为治疗和预防的靶点之一。