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乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是黄病毒科黄病毒属成员,通过侵害中枢神经系统引发人和猪、马、野生水禽等动物的病毒性脑炎,危害严重。因JEV具有神经毒力,对减毒活疫苗的安全性担忧使其仍不能被广泛接受。寻找JEV基因组中的毒力位点并探索其减毒机制是进一步研究JEV致病机理、研制安全有效的新型疫苗的关键。本研究以具有强神经毒力的JEV HEN0701株及其细胞传代致弱株HEN-10S3为研究对象,利用反向遗传操作技术,探索导致JEV毒力差异的分子基础及毒力增强或减弱的分子机制。JEV反向遗传操作系统的建立因其cDNA克隆在宿主菌中所具有的“遗传不稳定性”而受到阻碍。为了建立稳定的JEV全长感染性cDNA克隆,我们以HEN0701株基因组中极易发生突变的5’端序列区段(nt 1-2913)为研究对象,利用软件寻找影响病毒cDNA稳定性的相关序列,验证该序列对病毒cDNA克隆稳定性的影响,并对其进行定点突变和原核启动子活性的测定。结果发现,JEV基因组nt 54-120较高的原核启动子活性和JEV结构基因在宿主菌中的表达共同导致了JEV cDNA克隆在E.coli中难以稳定增殖。于基因组nt 1275与nt 1600之间截断E基因可以稳定cDNA克隆。于nt 90做A-C突变虽可降低原核启动子活性,但不能稳定克隆。室温(25°C)培养转化菌,nt 54-120的原核启动子活性有效降低,明显提高了2913-nt cDNA克隆在宿主菌中的遗传稳定性。因此,低温培养转化菌是提高黄病毒cDNA克隆在宿主菌中遗传稳定性的有效方法。以低温培养转化菌为基本前提,我们将HEN-10S3基因组全长分为相互重叠的四段,并在第一段5’端加上NotI酶切位点和T7启动子序列,在第四段3’末端加上HDV核酶序列和XhoI酶切位点。利用四条片段重叠序列以及pBR322M载体序列中合适的酶切位点,将四条片段于pBR322M中依次拼接成全长cDNA,构建HEN-10S3全长cDNA克隆pBAHC。经过体外转录并转染BHK-21细胞,获得拯救病毒vAHEN。经鉴定,拯救病毒与亲本毒在体外生长特性和对小鼠神经毒力两方面都具有相似特性。克隆pBAHC具有较好的稳定性且易于操作,连同本实验早期构建的HEN0701感染性克隆pJEHEN,为进一步深入研究JEV毒力差异提供了关键的技术平台。以HEN0701和HEN-10S3全长感染性cDNA克隆为基础,将两病毒5’-UTR和结构蛋白编码区序列(5’UTR-C-PrM-E)互换。分别构建了以HEN0701基因组为骨架嵌合克隆JE-H/5’-CPrME(S)和以HEN-10S3基因组为骨架的嵌合克隆JE-S/5’-CPrME(H),并拯救出嵌合病毒vJE-H/5’-CPr ME(S)和vJE-S/5’-CPrME(H)。对3w小鼠的毒力测试结果显示,与亲本毒相比,嵌合病毒神经毒力发生显著变化。vJE-S/5’CPr ME(H)毒力明显上升,表现出强毒特性;而vJE-H/5’CPrME(S)毒力显著下降,表现出弱毒特性。说明所替换序列对病毒毒力存在重要影响。由于在该序列中仅存在E蛋白第138位氨基酸(E-138 Glu/Arg)一个位点的差异,说明E-138位点可能是影响病毒神经毒力的关键位点。利用PCR定点突变技术,将HEN0701 E-138 Glu(E)分别突变为酸性氨基酸Asp(D),碱性氨基酸Arg(R)和Lys(K)及中性氨基酸Phe(F)、Ala(A)和Gln(Q)。将HEN-10S3 E-138 R突变成E-138E。并拯救突变病毒vHE138D、vHE138R、vHE138K、vHE138F、vHE138A、vHE138Q和vSE138E。突变病毒对3w小鼠的毒力测试结果显示,vHE138D和vSE138E具有强神经毒力;vHE138R和vHE138K无神经毒力;vHE138F、vHE138A和vHE138Q具有一定的神经毒力,介于之间。说明E-138确实是影响JEV神经毒力的关键位点,且毒力的强弱与该位点的酸碱性质有关。利用生物信息学软件分析HEN0701 E蛋白结构,发现E蛋白E-138与E-47位氨基酸在空间结构上相邻,以氢键相连,但连接方式随毒力不同而不同。为了研究E-47对病毒毒力的影响及其与E-138之间的关系,将HEN0701 E-47位Asn(N)分别突变为酸性氨基酸Asp(D)、碱性氨基酸Lys(K)和中性氨基酸Ala(A),拯救出突变病毒vHE47D、vHE47K和vHE47A。其对小鼠的毒力测试结果显示,vHE47D具有强神经毒力;vHE47K无神经毒力;vHE47A神经毒力介于之间。说明JEV E蛋白第47位氨基酸是能够影响病毒神经毒力的潜在毒力位点,且病毒毒力与该位点氨基酸的酸碱性质有关。根据本研究中所构建的14种重组病毒毒力差异与两位突变位点酸碱性质之间的关系,发现E-47与E-138位氨基酸的酸碱性质共同决定了病毒的神经毒力,酸性越强则毒力越强,当两个位点同时为酸性氨基酸时,病毒毒力最强。综上所述,本研究通过一系列试验发现在低温培养转化菌可以有效提高黄病毒cDNA克隆在宿主菌中的遗传稳定性,并在此基础上,成功构建了JEV弱毒株HEN-10S3全长cDNA感染性克隆,并拯救出与亲本毒特性相似的重组病毒。以此感染性克隆及强毒株HEN0701感染性克隆为工具,通过强、弱毒株间的嵌合和定点突变,首次发现影响JEV毒力的关键位点除E-138外,还有E-47,且两位点氨基酸的酸碱性质共同决定了JEV神经毒力。由于E-138与E-47空间位置相邻,推测其所在结构可能是影响病毒毒力的关键结构。