恶性肿瘤严重危害着人类的健康,而宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,它在女性生殖系统肿瘤发病率位居第二,在女性生殖系统肿瘤死亡率位居第五。每年全世界新发病例约有50万,其中约30万的患者因宫颈癌死亡。宫颈癌在中国的发病率排名世界第二位,严重危害着女性健康。目前HPV感染被公认为宫颈癌的必要条件,但并非充分条件。HPV的终身感染率累积可高达60%-70%,但其中仅2-3%的女性最终会发展成为宫颈癌患者。这表明还有其他辅助因素共同参与宫颈癌发病的病理机制。泛素—蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)是细胞内蛋白质降解的主要途径,参与细胞内80%以上蛋白质的降解,与疾病的发生发展关系密切。泛素—蛋白酶体系统包含多步骤酶聚反应,UPS由泛素、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、蛋白酶体及其蛋白质底物构成。E3酶通过泛素多聚化,在蛋白酶体降解蛋白的底物特异性中起到决定性的作用。显然若UPS的关键蛋白E3酶出现异常,很有可能导致机体发生疾病,包括癌症的发生发展。目前已知的E3泛素连接酶分成三大类：氨基端泛素连接酶、RING型锌指蛋白和HECT连接酶。迄今在人类组织细胞中发现了28个HECTE3连接酶。关于HECT结构E3连接酶的功能,最新研究显示其可调节包括基因转录和抑癌因子的降解等多种胞内进程。HECT结构的E3连接酶是一类单体酶,在心血管疾病(Liddle’s综合症)、神经紊乱(安琪儿综合症),以及一些疾病相关的过程如免疫反应、骨骼平衡和逆转录病毒出芽中起着重要作用,还参与癌症的发生、发展。通过调节(?)IECTE3酶的活性及其作用底物来探索恶性肿瘤的治疗方法：从底物蛋白中识别抑癌基因,或从癌症家族成员中发现基因突变和表达模式的改变来研究HECTE3连接酶与癌症之间的关系,从而寻找出专门针对HECT结构域的特异抑制剂来治疗恶性肿瘤等等,已经成为了目前国际上新的研究方向。G2E3是一个新的SI(ngle)-HECT E3酶,基因全长5581个碱基,编码706个氨基酸的蛋白,此蛋白含有一个HECT结构域及三个PHD结构域。2007年Brooks等首次证实G2E3具有E3酶活性。它只在细胞有丝分裂G2/M期表达,正常时定位于核仁,DNA受损后迅速重新穿过核膜进入细胞质,在发育中的神经系统内表达量较高。G2E3在早期胚胎发育中发挥重要作用,且表达下调引起凋亡增加。G2E3-/-囊泡在发育早期即大量凋亡,Yalan Xing等发现与G2E3具有相同高度保守RING域的pie对于果蝇生殖干细胞的自我更新及分化及早期胚胎发育至关重要。然而对于G2E3的其他生理功能特别是在肿瘤中的作用,均是一片空白。RNA干扰(RNA interfering,RNAi)现象是在体内的一种利用特异性的序列在转录后沉默基因的过程。如今在实验中采用化学合成法合成的siRNA对目的基因进行干扰的技术已经非常普遍和成熟,因此在本研究中也将采用化学合成siRNA-G2E3作为干扰G2E3表达的处理方法。为了探讨G2E3这个拥有特殊结构域的蛋白与肿瘤的关系,本研究以宫颈癌为研究对象,采用组织化学分析、干扰G2E3干扰等方法,对G2E3在宫颈癌中的表达以及其在Hela细胞中的功能进行研究,阐明G2E3的生理功能,探索G2E3可能参与肿瘤发生、发展过程的调节网络途径。研究方法：1.通过免疫组化结合组织芯片的方法,分析G2E3在12种器官肿瘤中的表达。2.采用免疫组化的方法分析36对宫颈癌组织,分析G2E3在宫颈癌及其匹配的癌旁组织中的表达。采用qPCR的方法分析19对宫颈癌组织,分析G2E3mRNA在宫颈癌及其匹配的癌旁组织中的表达。3.设计了三对干扰G2E3的siRNA序列,分别感染Hela细胞,Real-Time PCR和WB筛选出干扰效率最高的siRNA序列,用于后续实验。4.CCK8法检测转染后siRNA组,NC组及空转染组Hela细胞增殖的变化,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化,流式细胞仪检测各组细胞细胞周期及细胞凋亡情况。研究结果：1.通过对组织芯片分析,研究G2E3在12种器官肿瘤中的表达。结果显示,G2E3在12种人器官组织除乳腺癌中均有表达。G2E3在这12中器官组织细胞中主要表达在细胞质中,呈弥散性或颗粒性表达；部分组织细胞出现膜表达(宫颈癌旁组织和肾癌组织)；部分组织细胞出现核表达(胰腺癌旁组织和直肠癌组织),G2E3在其中5种器官肿瘤(结肠、卵巢、宫颈、皮肤和脑组织)中相对癌旁组织表达明显升高,在3种器官肿瘤(前列腺、胃、和肾)中相对癌旁组织表达明显降低,而另外四种器官肿瘤(肺、乳腺、食管和肝)中表达未见明显差异。2.对36对宫颈癌组织进行免疫组化分析,对19对宫颈癌组织进行qPCR分析。结果提示,G2E3高表达于宫颈癌组织而低表达于相应癌旁组织(t=3.138,P<0.005)。G2E3主要在细胞质中表达。3.筛选出了干扰G2E3表达效率最高的siRNA。用三对siRNA-G2E3分别感染Hela细胞。Real-Time定量PCR(P<0.05)和Western Blot(P<0.05)检测结果表明,第一对siRNA转染后对于Hela细胞内源性G2E3干扰效率最高,可用于后续实验。4.采用CCK8法检测干扰G2E3表达的Hela细胞和相应对照组细胞的生长情况,结果显示干扰G2E3表达能抑制Hela细胞的增殖(F=108.928,P<0.001)。划痕修复实验中,转染siRNA的干扰组,其细胞迁移距离低于对照组与空转染组(F=127.600,P<0.001)；在48h,干扰组的迁移距离与阴性对照组和空白组相比,差异有统计学意义(P<0.05),迁移距离明显小于其他各组。这证实干扰G2E3能抑制宫颈癌Hela细胞的增殖和迁移能力。5.流式细胞仪检测细胞周期,结果显示干扰组G2/M期百分比低于对照组(t=4.344,P<0.05),G1期百分比相差无统计学意义(t=0.725,P=0.509)。比较干扰组和对照组细胞凋亡率,两组间无明显差别(t=0.597,P=0.820)。研究结论：G2E3高表达于宫颈癌组织而低表达于相应正常组织,主要在细胞质中呈弥散性或颗粒性表达；部分组织细胞出现膜表达及核表达。设计并筛选出干扰效率高的siRNA用于后续细胞功能学实验。干扰G2E3可抑制人宫颈癌细胞系Hela细胞的增殖、迁移能力,并影响其细胞周期,据此推测抑制G2E3的表达使恶性肿瘤细胞的整体生存能力下降,同时抑制了恶性细胞的向外迁移。