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二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)是一种ω-3系列长链多不饱和脂肪酸,具有抗凝血、预防心血管疾病、降血脂等特殊生理功能,在保健品、食品和饲料行业均有较多的应用。产油微生物高山被孢霉(Mortierella alpina,M.alpina)已用于工业化生产花生四烯酸(Arachidonic acid,AA),其AA产量约占总脂肪酸的50%,常温条件下不产EPA,低温条件下EPA产量仅占总脂肪酸含量的2%左右。ω-3脂肪酸脱饱和酶具有催化AA生成EPA的作用,是ω-3长链多不饱和脂肪酸合成途径中的关键酶。本实验室前期成功将来源于寄生疫霉的脂肪酸脱饱和酶oPpFADS17在高山被孢霉中进行表达,重组菌中EPA含量显著提高。而还原力NADPH在脂肪酸合成过程中起关键作用,实验室前期成功将产生还原力的关键基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2在高山被孢霉中进行了表达,重组菌中总脂肪酸含量得到提升。本文为了同步提高高山被孢霉中总脂含量和EPA含量,尝试应用双表达盒策略和2A肽策略在高山被孢霉中同时表达ω-3脂肪酸脱饱和酶oPpFADS17基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2基因,分析两种基因对高山被孢霉重组菌合成EPA的作用。本课题主要结果如下:1.双表达盒策略中ω-3脱饱和酶oPpFADS17和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2共表达重组菌中总脂含量提高了20%左右。通过在表达载体上引入两个表达框,高山被孢霉重组菌总脂含量比野生型高山被孢霉提高了20%左右,G6PD2基因转录水平比野生型高山被孢霉提高了3-5倍,酶活水平比野生型高山被孢霉提高2倍左右,NADPH水平比野生型高山被孢霉提高了20%左右;实验结果分析表明,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在高山被孢霉重组菌中成功过表达,且有效促进高山被孢霉重组菌脂质的合成。高山被孢霉重组菌中EPA含量没有达到理论预期含量,我们首先从基因转录的角度进行了分析,发现高山被孢霉重组菌中ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因的转录水平比对照重组菌M.alpina-oPpFADS17降低20%左右;据此,我们推测ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因转录水平降低导致了高山被孢霉重组菌检测不到EPA含量的提高。2.2A肽策略中ω-3脱饱和酶oPpFADS17和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2共表达重组菌中EPA含量提高到占总脂含量的30.6%,AA转化为EPA的转化率达到77%。实验结果显示,与野生型高山被孢霉相比,高山被孢霉重组菌EPA产量提高到30.6%。转录水平结果显示,高山被孢霉重组菌中ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因的转录水平提高了20%左右,而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2基因的转录水平与野生型高山被孢霉相当;酶活水平和NADPH水平结果显示,重组菌中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2的活性及其提供的还原力NADPH与野生型高山被孢霉相当。据此,2A肽策略中过表达ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD2基因能够显著提高高山被孢霉重组菌中EPA含量,由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶所提供的还原力NADPH没有显著增加,造成了高山被孢霉重组菌中脂肪酸含量没有提高。