目的:慢性髓细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML)是一种血液系统恶性肿瘤,目前的一线用药伊马替尼(Imatinib,IM)在CML的治疗上取得了良好疗效,但其并不能清除白血病干细胞(Leukemia Stem Cells,LSC)。CML是一种对免疫治疗非常敏感的癌症,过继性免疫疗法为CML的治疗带来了新的曙光。其中嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)疗法由于具有高特异性、肿瘤细胞杀伤效应强、不受MHC限制等优势成为近几年过继性免疫细胞治疗中研究最为广泛的方法之一。CML与实体肿瘤组织相比不存在强大的免疫抑制微环境,其肿瘤细胞在外周血及骨髓中循环,将CAR-T细胞经静脉输注入体内,可以充分接触肿瘤细胞。因此CML是一种适合应用CAR-T细胞治疗的疾病。CAR-T的关键是寻找肿瘤细胞表面特异性的抗原,目前研究认为CD26抗原在CML-LSC上表达量高且具有特异性,可认定其为CML-LSC上特异的分子标记物。因此本研究拟制备靶向CML-LSC表面CD26抗原的CAR-T细胞,并探究其生物学效应。方法:将CML初诊病人及健康对照骨髓标本分离单个核细胞后经流式抗体CD34(PE)、CD38(APC)、CD26(FITC)对分选的单个核细胞进行标记染色,流式细胞分析仪检测CD26抗原在CD34~+/CD38~-的干细胞中表达情况。利用原核表达实验验证人源化抗CD26单链抗体(scFv)与CD26抗原的亲和性,构建pET32a-CD26-scFv重组质粒,诱导并纯化具有活性的重组蛋白CD26-scFv,利用间接免疫荧光和流式细胞术分析CD26-scFv与CD26抗原的亲和性。而后将靶标结合域CD26-scFv、铰链区及穿膜区CD8α、共刺激分子CD28、4-1BB及胞内信号转导域CD3ζ序列利用分子克隆技术构建第三代嵌合抗原受体(CAR)结构,并将其连接到慢病毒载体上构成pCDH-CD26-CAR重组质粒。选择慢病毒三质粒包装系统(pCDH-CD26-CAR、pMD2.G、pSPAX2)进行慢病毒制备并转导T细胞构建CD26 CAR-T细胞。最后通过CAR-T细胞体外增殖、凋亡实验、细胞因子释放检测等探究抗CD26 CAR-T细胞的体外生物学效应。结果:流式检测结果显示在CD34~+/CD38~-的LSC上CD26抗原表达量平均值为为29.26%,而在正常人CD34~+/CD38~-的HSC上CD26抗原表达量平均值为6.53%,两组比较P<0.05,差异有统计学意义。利用原核表达实验诱导表达并纯化了具有活性的重组蛋白CD26-scFv,间接免疫荧光和流式细胞术分析了CD26-scFv与CD26抗原的亲和性,实验结果证明CD26-scFv与CD26抗原的亲和性良好。利用二代慢病毒系统制备了CD26 CAR慢病毒,CD26 CAR转导T细胞构建CD26CAR-T细胞,流式检测其感染效率为30.06%,CCK8实验结果显示CAR-T细胞增殖不明显,FCM检测凋亡发现慢病毒转导96h后CD26~+的T细胞凋亡率达70%。结论:本课题研究鉴定了CD26抗原在CML-LSC的表达量及特异性,为杀伤CML-LSC提供了靶点支持。但我们构建的第三代CD26CAR-T细胞由于激活的T淋巴细胞表达CD26分子,且共刺激分子4-1BB的TRAF(TNF receptor associated factors)信号上调了细胞间粘附分子1,导致CD26 CAR-T细胞表现出广泛的自身抗原驱动的自相残杀,未能达到预期效果。但本文结果对改进CD26 CAR-T细胞的构建奠定了基础。