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研究目的:探索ChM-Ⅰ的上调表达诱导MSCs向软骨细胞方向分化的作用。
研究方法:
1.密度梯度离心法获得大鼠MSCs，传代培养并扩增。使用流式细胞仪检测细胞表面抗原(CD90、CD29)。将冻存的稳转pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ质粒的MSCs和稳转pcDNA3.1(+)质粒的MSCs复苏及扩培。
2.高糖DMEM无血清特定培养诱导液（含10ng/mlTGF-β1、100nmol/L地塞米松、50umol/ml抗坏血酸、1％ITS）
3.实验分六组(1):实验1组(稳定转染表达载体pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ的MSCs细胞组）(2):实验2组(稳定转染表达载体pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ的MSCs细胞+诱导液组）(3):对照1组（正常MSCs组）(4):对照2组（正常MSCs+诱导液组）(5):对照3组(稳定转染表达载体pcDNA3.1(+)的MSCs细胞组）(6):对照4组(稳定转染表达载体pcDNA3.1(+)的MSCs+诱导液组），细胞培养至7天、14天、21天三个时间点，通过使用倒置显微镜观察细胞形态的改变;甲苯胺蓝染色检测软骨基质的分泌情况;免疫细胞化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达情况。通过以上实验方法说明表达ChM-Ⅰ的大鼠MSCs细胞株具有向软骨细胞分化的能力。
研究结果:
1.MSCs细胞株的扩增培养及鉴定:
单细胞悬液接种48h后换液，倒置显微镜观察并拍照:可于培养皿底部见到呈梭形或三角形的贴壁细胞，培养11～13天后培养皿底部细胞密度达到85％以上。通过传代，细胞在6h内可达80％以上贴壁，细胞生长速度加快，可见细胞呈成纤维细胞样生长，折光性较强，群落呈鱼群样。流式细胞仪鉴定结果:MSCs阳性表面抗原CD90、CD29的表达率分别为99.79％、98.41％;MSCs阴性表面抗原CD45、CD11b/c的表达率分别为2.77％、2.51％。提示MSCs达到实验要求。
2.冻存的稳定转染表达载体pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ的MSCs细胞组和稳定转染表达载体pcDNA3.1(+)的MSCs细胞组复苏及扩培:常规复苏后，通过增值、传代，细胞生长旺盛，排列密集整齐，呈编织状、旋涡状。
3.六组细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化结果及分析:
实验2组诱导后的细胞和3个对照组的细胞由梭形向多边形转变。甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化结果显示:对照1、3组检测的特异性软骨基质的分泌和软骨Ⅱ型胶原的表达均为阴性;实验1组和对照2、4组均检测存在特异性软骨基质的分泌和软骨型Ⅱ胶原的表达，但实验1组为弱阳性，对照2、4组为阳性，说明ChM-Ⅰ的上调表达可诱导MSCs向软骨细胞分化，但不及TGF-β1的效率;实验2组检测软骨基质的分泌和软骨Ⅱ型胶原的表达呈强阳性，优于对照2、4组;实验2组和实验1组均能检测到特异性软骨基质的分泌和软骨Ⅱ型胶原的表达，且实验2组优于实验1组;说明稳定转染表达载体pcDNA3.1(+)/ChM-Ⅰ的MSCs细胞在TGF-β1的协同作用下向软骨细胞方向转化的能力显著提高。
研究结论:
1.本实验证明上调表达ChM-Ⅰ可诱导MSCs向软骨细胞分化。
2.在TGF-β1的协同作用下，上调表达ChM-Ⅰ的MSCs可提高向软骨细胞分化的能力。
3.多重表达载体和多种生物因子联合诱导MSCs可能成为构建组织工程软骨的重要方式。