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目的:成纤维细胞(FB)增殖异常是增生性瘢痕过度增生和持续存在的重要原因。本课题旨在探讨丝裂霉素C(MMC)对增生性瘢痕成纤维细胞(FB)增殖和凋亡效应的影响及机制,为增生性瘢痕的治疗提供理论依据。
方法:
1：应用手术中切取的增生性瘢痕组织作为体外原代和传代培养增生性瘢痕成纤维细胞的组织来源,细胞培养成功后,取3-6代生长状态良好且处于对数生长期的细胞用于实验。
2：实验分组及干预:分为正常对照组、不同浓度MMC干预组。MMC干预组分别用2.5μg/ml、12.5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的MMC处理细胞。正常对照组用10％FBS的DMEM培养液培养增生性瘢痕成纤维细胞;
3：采用四唑盐比色(MTT)方法,观察MMC对体外培养的增生性瘢痕FB增殖活性的影响。
4：用流式细胞术检测MMC对增生性瘢痕FB的细胞周期及凋亡发生率的影响。
5：采用蛋白印迹(Western-blot)技术检测Bax、Bcl-2和Smad7蛋白的表达情况。
6：数据处理采用SPSS11.5统计学软件进行,采用单因素方差分析和LSD-t检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果:
1：增生性瘢痕FB形态学观察
体外培养增生性瘢痕成纤维细胞呈典型的梭形、走向趋于一致,多呈平行排列,细胞中央有圆形或卵圆形核,核浆比例高。
2：采用四唑盐比色(MTT)方法,观察丝裂霉素对增生性瘢痕FB的细胞增殖活性的影响。
实验选用5种不同浓度(2.5μg/ml、12.5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的MMC分别干预增生性瘢痕成纤维细胞24h、48h、72h,利用MTT法测定药物的抑制率。在24h、48h、72h这3个时间段内,随着培养时间的增加,细胞生长抑制率呈现明显的上升趋势,并且RMMC浓度为2.5μg/ml～200μg/ml时,对细胞生长有明显的抑制效应,与对照组比较存在统计学差异(P＜0.05),显示明显的时间剂量依赖关系。
3：应用流式细胞技术检测MMC
对增生性瘢痕FB的细胞周期和细胞凋亡的影响流式细胞仪分析显示,2.5μg/ml～200μg/ml不同浓度MMC作用成纤维细胞24h后,与对照组比较,G0/G1期细胞增多,S期和G2/M期细胞减少,见显著性差异(P＜0.05)。另外,2.5μg/ml～200μg/ml不同浓度MMC处理细胞24h后,从凋亡图中可以看出,随着MMC的浓度逐渐增加,增生性瘢痕FB早期凋亡呈上升趋势,并且晚期凋亡和死亡率也明显上升,这提示MMC可使增生性瘢痕FB的生长阻滞于G0/G1期,并且能够诱导增生性瘢痕FB发生凋亡,有着明显的浓度依赖性。
4：采用蛋白印迹(Western-blot)技术检测Bax、Bcl-2和Smad7蛋白的表达情况。
Western-Blot检测显示:经2.5μg/ml～200μg/ml不同浓度的MMC作用增生性瘢痕FB24h,Bax蛋白表达量增高,Bcl-2蛋白表达量降低,Smad7蛋白表达量增加,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。提示丝裂霉素可以影响Smad,Bax/Bcl-2途径从而发挥促进增生性瘢痕FB凋亡的作用。
结论:
1：2.5μg/ml～200μg/mlMMC对增生性瘢痕FB的增殖起到抑制作用,同时诱导Smad7蛋白的表达。
2：Bcl-2和Bax等凋亡相关基因参与了增生性瘢痕形成的调控,并且凋亡受阻可能是增生性瘢痕形成的原因之一。MMC能导致增生性瘢痕成纤维细胞Bax表达增高,Bcl-2表达降低,从而促进成纤维细胞凋亡增加。
3：本研究结果提示,MMC对增生性瘢痕有抑制作用。