日本三角涡虫DjINX-11蛋白多克隆抗体制备及鉴定

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日本三角涡虫属扁形动物门涡虫纲的一种淡水涡虫,因其具有超强的再生能力,是研究动物再生的良好模式动物之一。涡虫的再生是由其体内唯一具有分裂增殖和分化能力的成体干细胞neoblasts介导的。因此,neoblasts生物学特性研究对揭示涡虫再生及修复机制具有重要的意义,如何鉴别neoblasts是研究前提。早期neobalsts的鉴别主要依赖形态学特征—细胞呈圆形或椭圆型,体积较小,具有较大核质比,细胞质内含有不均匀分布的拟染色质,形态学鉴别对仪器设备要求较高,需要一定的经验,鉴定结果不准确,无法对neoblasts进行精细鉴别;随着分子生物学的发展,根据neoblasts是“涡虫体内唯一具有分裂增殖和分化能力的细胞”这一特征,采用细胞分裂过程中特异的分子作为neoblasts的特异性分子标记,采用的方法一般为原位杂交或抗体介导的免疫组化,但这些分子标记均为细胞内标记,操作过程繁琐,所需时间长,对细胞损伤大。为简化日本三角涡虫neoblasts的标记过程,建立简便、快捷、特异的标记方法,本文选取neoblasts特异性间隙连接蛋白DjINX-11为标记的目标蛋白,用DNASTAR Lasergene软件和在线工具TMHMM Server v.2.0对DjINX-11的抗原性、亲水性及跨膜域进行分析,选择该蛋白第1个胞外环中抗原性较强的序列(55-111位氨基酸)为靶序列,构建该片段原核表达载体,转化BL21感受态细胞,用终浓度为0.4 mM的IPTG37℃诱导表达3h,对诱导产的进行SDS-PAGE分析,纯化抗原,制备相应的多克隆抗体。通过细胞荧光实验结合DjINX-11的编码基因Djinx-11和neoblasts特异性标志基因DjpiwiA双色荧光原位杂交实验对制备抗体的特异性进行检测。结果显示:所制备的多克隆抗体标记的阳性细胞具有较大的核质比,符合neoblasts的形态学特征;Djinx-11与DjpiwiA双色荧光原位杂交显示,DjpiwiA阳性细胞与Djinx-11阳性细胞完全重叠,Djinx-11阳性细胞中仅部分细胞为DjpiwiA阳性,但Djinx-11阳性细胞均具有neoblasts的形态学特征,因此,DjINX-11除标记标记neoblasts外,还标记具有neoblasts特征但DjpiwiA阴性的其它细胞。总之,本研究成功制备了抗DjINX-11多克隆抗体,为研究该蛋白功能及相关细胞生物学特征奠定了基础。
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