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目的： 紫杉醇是一种新型的天然抗肿瘤药物,其源于太平洋紫杉树树皮。具有稳定细胞微管的独特作用机制。抗瘤谱广,疗效好。紫杉醇是目前临床应用最广泛的化疗药物之一,其剂量限制性毒性主要为神经毒性和骨髓抑制,后者已经成功通过应用粒细胞集落刺激因子予以克服,但表现为神经病理性疼痛的神经毒性至今仍然困扰着全世界的临床医生,这是因为此种化疗所致疼痛对任何目前临床上所使用的镇痛药物都不敏感,这在一部分病人中常常导致被迫减量直至停药,从而严重影响化疗效果甚至使化疗归于失败,部分紫杉醇化疗痛并不会因为停药而迅速终止,常常迁延数月甚至数年,严重影响肿瘤患者的生存质量。 紫杉醇化疗痛与其它神经病理痛一样对阿片类药物不敏感,与其它诸如慢性坐骨神经损伤(CCI),脊神经结扎损伤(SNL),部分神经损伤(SNI)等神经病理痛不一样的是,紫杉醇化疗痛不能被预注NMDA受体拮抗剂MK801所阻断,提示紫杉醇化疗痛的信号传导通路有别于其它类型的神经病理痛。目前关于紫杉醇化疗痛的信号传导通路的详细研究尚不多见。蛋白激酶 A(PKA)和蛋白激酶 C(PKC)是一类可使底物蛋白内丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化的蛋白激酶超家族,是疼痛信号传递中的重要钙依赖性第二信使。实验证明脊髓背角神经元内PKA和PKC的激活可以增高神经元的兴奋性,由此对外周传入信号的反应增强,导致痛觉异常,是炎性疼痛和神经病理性痛发生的主要机制之一,应用PKA和PKC抑制剂可以阻断或者是逆转炎性痛和神经病理性疼痛,而PKA和PKC是否在紫杉醇所致外周神经病理性疼痛的发病机制中发挥作用目前尚不清楚。 本研究旨在探讨建立紫杉醇致大鼠外周神经病理性疼痛模型的可行性,并在此基础之上研究PKA和PKC在紫杉醇所致外周神经病理性疼痛发病机制中的作用,为临床治疗该类疼痛提供新的治疗方向。 方法和结果： 1.紫杉醇致大鼠外周神经病理性疼痛模型的建立 方法:40只成年雄性SD大鼠随机分为四组(每组10只),分别在第1,3,5,7天腹腔注射紫杉醇0,0.5,1,2mg/kg,观察各组大鼠的一般情况并记录大鼠每天的体重变化,分别于用药前和用药开始后的第3,5,7,12,16,20和25天测定大鼠的机械缩足反射阈值(MWT)和热缩足潜伏期(TWL),用药后第20天透射电镜观察大鼠坐骨神经超微结构的变化。 结果:实验期间四组大鼠体重均缓慢增长,四组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。腹腔注射1mg/kg紫杉醇组大鼠最早在用药的第5天大鼠出现机械痛敏和热痛敏,机械痛阈在用药的第12天达到最小,而热痛敏在用药的第16天达到最小。腹腔注射紫杉醇组大鼠的坐骨神经纤维髓鞘板层结构松散、肿胀变形,排列紊乱,厚薄不均。 2. PKA和PKC在紫杉醇致大鼠外周神经病理性疼痛发病机制中的作用 方法:雄性SD大鼠20只,体重230-250g,随机分为2组(n=10),对照组和紫杉醇组。紫杉醇组分别在第1、3、5、7天腹腔注射紫杉醇1mg/kg/d(溶于1ml生理盐水中);对照组在第1、3、5、7天给予与紫杉醇组等体积的紫杉醇溶剂聚氧乙基蓖麻油(溶于1ml生理盐水中);两组分别于第1、3、5、7、12、16、20天测定大鼠体重、大鼠后肢机械缩足反射阈值(MWT)和热缩足潜伏期(TWL),第16天测痛后,两组各取大鼠6只,断头处死并迅速分离L4-6脊髓,分别应用Western Blot方法检测大鼠脊髓p-PKA、p-PKC、p-CaMKIIa的表达和Real-time PCR检测大鼠脊髓PKA、PKC和CaMKIIa mRNA的表达。 结果:紫杉醇组大鼠在腹腔注射紫杉醇的第5天表现出机械痛敏和热痛敏。Western Blot结果显示紫杉醇组p-PKA和p-PKC表达明显高于对照组,差异具有统计学意义( P<0.05),而紫杉醇组 p- CaMKIIa的表达与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。Real-time PCR结果显示紫杉醇组PKA和PKC mRNA表达明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而紫杉醇组CaMKIIa mRNA的表达与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。 3.鞘内注射PKA或PKC抑制剂对紫杉醇致大鼠外周神经病理性疼痛的影响 方法:雄性SD大鼠40只,体重230-250g,随机分为4组(n=10):空白对照组(Na?ve)、生理盐水组(NS)、PKA抑制剂组(PKA)和PKC抑制剂组(PKC)。后三组大鼠在第1、3、5、7天腹腔注射紫杉醇1mg/kg/d(溶于1ml生理盐水中),然后在第9、11、13天测痛完毕后鞘内分别注入生理盐水、PKA抑制剂和PKC抑制剂20μl,而空白对照组在第1、3、5、7天给予与实验组等体积的紫杉醇溶剂聚氧乙基蓖麻油。持续观察各组大鼠行为学改变,分别于用药前1天以及用药的第1、3、5、7、9、11、13和15天测定各组大鼠后肢的机械缩足反射阈值(MWT)和热缩足潜伏期(TWL)。然后于第15天测痛完毕后处死各组大鼠,取L4-6节段脊髓组织,应用免疫组织化学ABC法检测脊髓背角PKA和PKC的表达。 结果:与Na?ve组相比,NS组、PKA组和PKC组第5-9天大鼠各时间点机械痛阈和热痛阈明显降低(P<0.05),PKA组和PKC组在第11-15天与Na?ve组相比大鼠各时间点机械痛阈和热痛阈无明显差异(P>0.05),而与NS组相比大鼠各时间点机械痛阈和热痛阈有显著性差异(P<0.05)。脊髓背角PKA在NS组表达明显高于Na?ve组和PKA组,脊髓背角PKC在NS组表达明显高于Na?ve组和PKC组。 4、统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行处理。计量资料以均数±标准差(± s)表示,行为学测定的组间比较采用重复变量数据的方差分析;其余计量资料采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。 结论： 1.使用雄性SD大鼠重复腹腔注射1mg/kg紫杉醇的方法可以成功建立紫杉醇致大鼠外周神经病理性疼痛模型。 2.紫杉醇致大鼠外周神经病理性疼痛的机制依赖于PKA和PKC而不是CaMKIIa的激活,脊髓背角神经元内PKA和PKC的激活在紫杉醇化疗痛的信号传递中起着很重要的作用。 3.鞘内注入PKA或PKC抑制剂后可以分别抑制紫杉醇所致神经病理性疼痛大鼠模型中的脊髓背角神经元内PKA或PKC的表达上调,明显减轻紫杉醇所致的机械痛敏和热痛敏。