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镉是一种高毒性的环境和工业污染物,急性或慢性镉暴露能引起多种器官和组织的损伤。镉可以引起血脑屏障功能障碍,进入脑组织引起神经元凋亡,临床研究表明镉是导致儿童学习障碍和神经退行性疾病发生的重要原因。微摩尔级的镉能引起丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的激活,导致线粒体的功能紊乱、线粒体膜电位下降、通透性发生变化、线粒体内物质释放进入胞浆。但是线粒体途径在镉诱导神经细胞凋亡过程中的作用机制仍存在疑问。本研究以体外培养大鼠大脑皮质神经元和PC12细胞为模型,通过体外试验探讨线粒体途径在镉诱导神经细胞凋亡中的作用机制,MAPK的激活在线粒体途径中的作用,以及乙酰半胱氨酸(NAC)在上述过程中的保护作用。1、镉诱导神经细胞凋亡为研究镉对神经细胞的凋亡作用,不同浓度(0、5、10、20μmol/L)醋酸镉处理原代细胞和PC12细胞12h或24h,MTT法测定细胞存活率,Annexin V-FITC染色法测定细胞凋亡率。结果表明,随着镉剂量的增加,神经细胞的存活率逐渐下降,12h和24h各剂量染镉组细胞存活率均显著或极显著(P<0.05或P<0.01)低于对照组；随着镉剂量的增加,细胞皱缩,脱落,轴突、树突和神经网络消失,Annexin V阳性细胞数量与对照组相比呈显著或极显著(P<0.05或P<0.01)增加。说明镉诱导原代细胞和PC12细胞凋亡存在剂量-效应关系。2、镉诱导神经细胞凋亡的线粒体途径为研究线粒体途径在镉诱导神经细胞凋亡中的作用,本试验以原代细胞和PC12细胞为模型,0-20μmol/L醋酸镉处理细胞24h。免疫印迹法检测线粒体途径相关蛋白Cyt C的释放,Caspase-3和PARP活化,Bax和Bcl-2表达量,Z-VAD-frnk对Caspase依赖性途径的影响；并运用免疫荧光染色法检测AIF和EndoG核转位。结果表明,与对照组相比,随着镉浓度的增大,Cyt C的释放,Caspase-3和ARP活化显著或极显著(P<0.05或P<0.01)升高。添加100μmol/L的Z-VAD-frnk能抑制镉引起的原代细胞Caspase-9、Caspase-3和PARP的活化,细胞存活率的下降,细胞核形态的变化。与对照相比,10μmol/L醋酸镉处理PC12细胞能引起AIF和EndoG核转位。这表明镉能通过线粒体途径诱导神经细胞凋亡(包括Caspase依赖性和非Caspase依赖性途径)。3、镉诱导神经细胞凋亡的MAPK途径为研究MAPK激活在镉诱导神经细胞凋亡中的作用,本试验以原代细胞和PC12细胞为模型,0-20醋酸镉处理细胞不同时间,免疫印迹法或免疫组化染色法检测MAPK成员ERK.JNK和p38MAPK活化；MAPK特异性磷酸化抑制剂与镉联合作用原代细胞和PC12细胞,检测抑制剂对ERK、JNK和p38MAPK磷酸化活化的抑制作用,以及抑制MAPK磷酸化对细胞存活率、凋亡率的影响。结果表明,10μmol/L镉作用PC12细胞1h后,ERK磷酸化水平开始升高,一直到12h都高于对照组；JNK和p38MAPK的磷酸化水平于镉作用4h后开始升高,一直维持到12h,呈时间-效应关系。5、10、20μmol/L镉处理原代细胞和PC12细胞后ERK、JNK、p38MAPK磷酸化水平均呈显著或极显著(P<0.05或P<0.01)上升,呈现剂量-效应关系。ERK的磷酸化抑制剂U0126(10μmol/L)、JNK的磷酸化抑制剂SP600125(20μmol/L)和p38MAPK的磷酸化抑制剂ISB202190(20μmol/L)与镉联合作用能分别降低镉引起的ERK、JNK和p38MAPK磷酸化水平的升高。U0126和SP600125能显著或极显著(P<0.05或P<0.01)抑制镉引起的原代细胞和PC12细胞存活率下降和凋亡率升高。表明ERK和JNK参与调控镉引起的原代细胞和PC12细胞凋亡。4、ERK、JNK调节镉诱导神经细胞凋亡的线粒体途径为研究ERK、JNK的激活在镉诱导神经细胞凋亡的线粒体途径中的作用,本试验以原代细胞和PC12细胞为模型,ERK抑制剂U0126(10μmol/L)和JNK抑制剂SP600125(20μmol/L)与镉联合作用原代细胞和PC12细胞。免疫印迹法检测线粒体途径相关蛋白CytC的释放,Caspase-3和PARP活化,Bax和Bcl-2表达量；免疫荧光染色检测AIF和EndoG核转位。结果表明,与10μmol/L镉处理组相比,抑制ERK、JNK的磷酸化能显著或极显著(P<0.05或P<0.01)抑制镉引起的CytC的释放、Caspase-3和PARP的激活、Bcl-2/Bax比值的下降；AIF和Endo G的核转位。表明ERK、JNK的激活参与调控镉通过线粒体途径诱导的神经细胞凋亡(包括Caspase依赖性和非Caspase依赖性途径)。5、NAC在镉诱导神经细胞凋亡中的保护作用为研究NAC在镉诱导神经细胞凋亡中的保护作用,本研究用10醋酸镉和NAC(100单独或联合作用PC12细胞24h。MTT检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,比色法检测30D、GSH-Px、CAT活力和MDA含量,免疫印迹检测CytC的释放,Caspase-3和PARP活化,Bax和Bcl-2表达量,免疫荧光染色检测AIF和EndoG核转位。结果表明,NAC能显著或极显著(P<0.05或P<0.01)抑制镉引起的PC12细胞存活率下降和凋亡率上升；CAT活力上升,GSH-Px活力下降,MDA含量上升；CytC的释放、Caspase-3和PARP的激活、Bcl-2/Bax比值的下降；AIF和Endo G的核转位。表明NAC能抑制镉通过线粒体途径诱导的原代细胞和PC12细胞凋亡。