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背景:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种慢性、系统性、炎症性自身免疫性疾病,其病理改变是机体免疫功能紊乱导致的滑膜增生、血管翳形成、骨及软骨组织的破坏。有研究的表明,Treg/Th17细胞的平衡失调对RA的发生、发展起着至关重要的作用[1,2]。间充质干细胞(Mesenchyma Stem Cells,MSCs)已被证实是一种具有高度增值能力和多向分化潜能的细胞[3],可通过调节炎症细胞及因子的表达,达到治疗RA的目的。近几年研究发现,间充质干细胞来源的微泡(Mesenchymal Stem Cells derived Microvesicles,MSC-MVs)同样具有免疫调节作用[5],同时可避免细胞治疗引起的血管栓塞、异位成骨等风险,因此逐渐成为新型的研究热点。目的:通过体外培养人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)及分离人脐带间充质干细胞来源的微泡(human umbilical cord mesenchymal stem cells derived microvesicles,hUCMSC-MVs),将hUCMSC-MVs与RA患者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)体外共培养,观察hUCMSC-MVs对RA患者PBMC中Th17细胞、Treg细胞及炎性因子IL-17A、IL-1a、IL-2、TNF-α、TGF-β、IL-10表达的影响,探讨hUCMSC-MVs治疗RA是否有效,作用强度如何,是否与其浓度相关,进而从炎症细胞及因子途径阐述hUCMSC-MVs治疗RA可能的作用机制。方法:1.hUC-MSCs和hUCMSC-MVs的分离、鉴定(1)huc-mscs的分离、培养和鉴定:采用组织块培养方法体外分离、培养huc-mscs,倒置显微镜下观察其形态,流式细胞术检测表面抗原cd29、cd44、cd105、cd73、cd90、cd166、cd34、cd45,并在特定条件下对huc-mscs的成骨、成脂分化潜能进行鉴定;(2)hucmsc-mvs的分离和鉴定:huc-mscs“饥饿”培养24小时,使用差速离心提取上清液中的微泡,使用透射电镜观察其形态,并采用bca方法在酶标仪上测定其蛋白质含量。2.hucmsc-mvs与ra患者pbmcs共培养,观察其对th17细胞、treg细胞及相关炎性因子表达水平的影响(1)实验分组:共5组,分别是空白对照组、huc-mscs组(2×106个)、hucmsc-mvs组(30μg)、hucmsc-mvs组(60μg)、hucmsc-mvs组(90μg)。(2)检测指标:⑴流式细胞术测定th17细胞、treg细胞表达水平。⑵流式高通量多因子检测技术测定培养上清中促炎因子il-17a、il-1a、il-2、tnf-α和抗炎因子tgf-β、il-10的表达水平,收集数据做统计分析。结果:1.huc-mscs和hucmsc-mvs的分离、鉴定(1)huc-mscs的分离、培养和鉴定:倒置显微镜下观察细胞排列较整齐,呈较为均一的长梭形,类似成纤维细胞样外观。经流式细胞术检测,细胞表面cd29、cd44、cd73、cd90、cd105和cd166呈阳性表达,cd34、cd45成阴性表达。huc-mscs经成骨诱导分化,钙钴法染色成阳性;经成脂诱导分化,油红o染色成阳性;(2)hucmsc-mvs的分离和鉴定:经透射电镜观察,显示离心所得产物为一类直径介于40nm-300nm之间大小不一的囊泡状结构,重悬后蛋白质浓度约2.05μg/μl。2.hucmsc-mvs在体外与ra患者pbmc混合培养(1)各实验组均可下调th17细胞及il-17a、il-2、il-1、tnf-α的表达,增加treg细胞表达,差别有统计学意义(p<0.05);hucmscs组和中、高浓度mvs组均可上调tgf-β、il-10水平,差异有统计学意义(p<0.05);(2)高浓度mvs组在下调th17细胞及il-17a、il-1a、tnf-α的表达和增加Treg细胞及TGF-β、IL-10的表达方面,作用优于低、中浓度MVs组,差异有统计学意义(P<0.05);(3)高浓度MVs组和hUC-MSCs组均可下调Th17细胞及IL-17A、IL-1a、TNF-α的表达,增加IL-10的表达,差别无统计学意义(P>0.05)。结论:1.本实验室培养的hUCMSCs及分离的hUCMSC-MVs基本符合国际标准;2.hUCMSCs和hUCMSC-MVs均可调节Th17/Treg的失衡,下调Th17细胞及促炎因子IL-17A、IL-1a、IL-2、TNF-α的水平,上调Treg细胞及抗炎因子TGF-β和IL-10的水平;高浓度MVs组的免疫调节作用优于低、中浓度组,且不弱于其母体细胞。