酿酒酵母不对称合成手性药物中间体及其相关还原酶催化功能的研究

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手性扁桃酸甲酯是一种重要的药物中间体,可用于合成血管扩张药环扁桃酯、眼科药物羟苄唑及中枢神经兴奋药匹莫林。(R)-(-)-扁桃酸甲酯可通过生物催化不对称还原苯甲酰甲酸甲酯而获得。光学活性的(S)-(-)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)是合成Slagcnins B和C以及HMG-CoA还原酶抑制剂的关键手性中间体。(S)-CHBE可通过生物催化不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯而获得。 本论文以苯甲酰甲酸甲酯和4-氯乙酰乙酸乙酯为模式底物,对Saccharomyces cerevisiae LH1催化的生物反应过程中的主要参数进行了详细的研究。在对催化体系和转化条件的研究中发现,S.cerevisiae LH1菌株在催化酮酯还原反应时表现出很高的对映体选择性,而且对映体过量值受环境因素的影响非常小。S.cerevisiae LH1的上述特性,对羰基化合物的还原反应来讲,是一个明显的优势。 在摇瓶条件下对生物催化剂(酿酒酵母)进行了优化;在优化的培养条件下,酵母细胞催化苯甲酰甲酸甲酯还原的能力比优化前提高了15%,R-型产物的ee值保持在95%以上;酵母细胞催化4-氯乙酰乙酸乙酯还原的能力比优化前提高了10%,S-型产物的ee值保持在94%以上。 另外,本文将目的基因(Gre2、Adh7、Sfa1和Yp1088w)在工程酵母菌和大肠杆菌中克隆表达,将重组菌用于系列羰基化合物的还原,对酿酒酵母中四种还原酶/脱氢酶的催化功能进行了鉴定。三种分别由Adh7、Sfa1和Yp1088w编码的还原酶能够催化苯甲酰乙酸乙酯生成(S)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯,而Gre2编码的还原酶催化苯甲酰乙酸乙酯时倾向于生成(R)-3-羟基-3-苯基丙酸乙酯。此四个基因编码的还原酶催化苯甲酰甲酸甲酯时均倾向于生成R-型的产物,催化苯乙酮和苯丙酮时均倾向于生成S-型的产物。本文首次证明了Adh7、Sfa1和Yp1088w编码的还原酶具有催化酮酯还原的功能。
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