本论文选择一株能产生麻痹性贝毒(paralytic shellfish poisoning, PSP)的赤潮甲藻塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense, ATHK株)，研究了其对我国北方池塘主要水产养殖品种—中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)免疫功能和抗病力的影响，探讨有毒藻类对养殖对虾疾病的诱发机制。研究分为三个部分：第一部分为塔玛亚历山大藻对中国对虾毒性的初步研究。对塔玛亚历山大藻ATHK藻株在实验室培养的条件下生长情况进行了研究；利用美国分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists, AOAC)所推荐的小鼠生物法(mouse bioassay, MBA)测定了不同生长时期和不同培养温度下的塔玛亚历山大藻的麻痹性贝毒毒性；采用浸浴方式研究了藻株对中国对虾的急性毒性；采用HE染色的方法，分别对在浸浴(1.0×104cells/mL组)和注射(6.63×104cells/mL组)后96h的中国对虾的鳃和肝胰腺石蜡切片进行了观察。结果表明，藻株属中温株，最适生长温度为20°C，此温度下生长率为0.24d-1；在最适生长温度下培养，藻株单位细胞毒性为1.85×10-5-4.57×10-5MU/cel1(3.50-8.64pgSTX Equal/cell)，在对数生长末期达最大值，在同种藻株中属低毒藻株；单位细胞毒性在本实验所设的温度范围(16-32°C)内随温度增加而呈下降趋势；塔玛亚历山大藻对中国对虾96h半致死浓度(median lethal concentration, LC50)为1.0×104cells/mL，安全浓度(safe concentration, SC)为1.0×103cells/mL；石蜡切片观察发现塔玛亚历山大藻和其毒素粗提液分别引起了对虾鳃和肝胰腺出现细胞肿胀、空泡化等病理变化。第二部分为塔玛亚历山大藻对中国对虾鳃和肝胰腺组织SOD、GST、MDA和细胞凋亡的影响塔玛亚历山大藻粗提液经肌肉注射方式染毒中国对虾，于染毒后1、3、6、12、24和48h测定肝胰腺和鳃组织的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)，谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性和丙二醛(malonyldialdehyde,MDA)含量的影响。采用浸浴方式研究暴露于200cells/mL和1000cells/mL塔玛亚历山大藻中中国对虾鳃和肝胰腺的SOD活性、GST活性、MDA含量和Caspase(cysteinylaspartate specific proteinase, Caspase)基因(FcCasp)相对表达量，并对暴露96h后的中国对虾肝胰腺细胞凋亡情况利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(TdT mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法进行了检测。结果显示：注射染毒后1-6h,对虾肝胰腺和鳃组织SOD，GST活性均增加，12和48h鳃组织的上述指标受到抑制(P<0.05)。对虾肝胰腺MDA含量除1h外未见明显改变(P>0.05)，鳃中MDA含量随时间增加呈升高趋势。200cells/mL塔玛亚历山大藻胁迫下，中国对虾鳃SOD活性、GST活性、MDA含量和FcCasp相对表达量均随着取样时间推移整体表现出先上升后下降的趋势。1000cells/mL塔玛亚历山大藻胁迫下，鳃SOD活性随时间增加呈现先升高后降低的趋势，在24-96h被显著抑制(P<0.05)，鳃GST活性除3和48h外均被显著抑制(P<0.05)，MDA含量和FcCasp相对表达量均整体表现上升的趋势，呈现出一定的时间效应。200cells/mL塔玛亚历山大藻胁迫下，肝胰腺SOD活性、GST活性、MDA含量和FcCasp相对表达量除个别时间点外，无显著改变(P>0.05)。1000cells/mL塔玛亚历山大藻胁迫下，肝胰腺的SOD和GST活性均随着取样时间推移整体表现出先上升后下降的趋势，肝胰腺MDA含量在48-96h显著上升(P<0.05)，且在此时间段内肝胰腺MDA含量上升的趋势和其GST活性下降的趋势相一致。相关性分析显示塔玛亚历山大藻胁迫下，中国对虾鳃和肝胰腺的MDA含量和FcCasp相对表达量呈正相关(相关系数R2分别为0.8663和0.8606，P<0.05)。TUNEL分析显示，1000cells/mL塔玛亚历山大藻胁迫96h，中国对虾的肝胰腺出现明显的细胞凋亡。研究表明：塔玛亚历山大藻及其毒素对中国对虾组织具有脂质过氧化(lipid peroxidation, LPO)作用，引起MDA含量增加，SOD和GST活性降低。塔玛亚历山大藻可造成中国对虾氧化损伤，从而导致FcCasp表达上调，诱导细胞凋亡。MDA含量和Caspase基因表达水平呈线性相关，表明了LPO在诱导细胞凋亡中的作用。中国对虾鳃组织中SOD活性，GST活性和MDA含量在塔玛亚历山大藻浓度高于200cells/mL对塔玛亚历山大藻的变化有积极的响应，其随藻浓度及其作用时间的不同而发生不同的变化，在作为有毒藻暴露的生物标记物方面有较好的应用前景。第三部分为塔玛亚历山大藻对中国对虾免疫相关基因表达和抗病力的影响。克隆获得了中国对虾一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)基因全长序列、分析该基因的特征、检测了NOS在对虾各个组织的表达情况及副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)(5×106CFU/mL)刺激下在对虾鳃和肝胰腺组织的表达情况；并研究了暴露于200和1000cells/mL塔玛亚历山大藻中中国对虾鳃和肝胰腺NOS基因的表达变化情况及暴露于不同浓度(100,200,500,1000,2000和4000cells/mL)塔玛亚历山大藻后机体抗副溶血弧菌能力；研究了暴露于200和1000cells/mL塔玛亚历山大藻中中国对虾TLR基因和Relish基因的表达变化情况及抗白斑病毒(white spot syndrome virus, WSSV)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的能力。结果表明，NOS基因全长4616bp，包含3582bp的开放阅读框(ORF)，编码一个由1193个氨基酸组成的多肽，起始密码子(ATG)位于164-166位核苷酸，终止密码子(TAG)位于3743-3745位核苷酸，5′和3′的非编码区分别为163bp和871bp，含有四个ATTTA基序。NOS推导的氨基酸序列通过SMART进行比对分析，发现该蛋白有从无脊椎动物到脊椎动物都比较保守的多个蛋白家族保守序列，主要包含4个结构域：NO synthase结构域，flavodoxin1结构域，黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合域和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)结合域。中国对虾NOS蛋白氨基端血红素(Heme)和四氢叶酸(BH4)结合位点，羧基端黄素单核苷酸(FMN)、FAD和还原型烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸(NADPH)结合位点，在脊椎动物三种类型NOS和无脊椎动物间也都高度保守。中国对虾NOS与昆虫NOS聚为一支，与脊椎动物的组成型NOS进化关系更近，与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)的同源性分别为97%和95%。中国对虾NOS基因在鳃中的表达量最高，其次为肝胰腺。副溶血弧菌注射后中国对虾鳃和肝胰腺组织NOS基因在最初阶段的表达量都显著上调。200cells/mL塔玛亚历山大藻胁迫下，中国对虾的鳃和肝胰腺的NOS基因表达在实验初期有所上升，实验中后期均恢复至对照组的水平，而1000cells/mL塔玛亚历山大藻胁迫下对虾鳃和肝胰腺组织的NOS基因表达分别在12h后和72h后被显著抑制(P<0.05)。不同浓度塔玛亚历山大藻(100,200,500,1000,2000和4000cells/mL)暴露6天后的中国对虾，经副溶血弧菌人工急性感染后，中国对虾的累积死亡率在各时间点整体上呈现随藻浓度的增加而增加的趋势，500,1000,2000和4000cells/mL塔玛亚历山大藻胁迫组的累积死亡率在24,48和72h均显著高于对照组(P<0.05)，而100和200cells/mL塔玛亚历山大藻胁迫组在24,48和72h的累积死亡率与对照组相比无显著差异(P>0.05)。200cells/mL塔玛亚历山大藻胁迫72-144h，中国对虾的肝胰腺、鳃和血淋巴的TLR和Relish基因表达或被显著抑制(P<0.05)，或恢复至海水对照组的水平(P>0.05)。而1000cells/mL藻中对虾鳃组织和血淋巴的上述基因表达在48-144h被显著抑制(P<0.05)，肝胰腺的表达在72-144h被显著抑制(P<0.05)。塔玛亚历山大藻胁迫下投喂感染WSSV的病虾后，加藻的感染组(200和1000cells/mL)和未加藻的感染组的中国对虾虽然都在第3天时检测到阳性结果，7天内累积死亡率均为100%，但同一时间点加藻组的累积死亡率高于未加藻组。塔玛亚历山大藻胁迫6天后的中国对虾，经鳗弧菌人工急性感染后，200和1000cells/mL组在同一取样时间点的累积死亡率高于未加藻的海水对照组，且随着藻浓度升高而有升高的趋势。研究表明NOS在对虾的免疫防御中发挥重要的作用，NOS可以作为反应对虾免疫系统的指标。塔玛亚历山大藻可影响中国对虾免疫相关基因NOS、TLR和Relish的表达，从而影响机体的抗病力。因此，在对虾养殖中为降低对虾感染WSSV、鳗弧菌和副溶血弧菌的风险，有毒亚历山大藻的浓度应控制在200cells/mL以下。