一、研究背景前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是世界最常见的泌尿系恶性肿瘤,在西方国家,前列腺癌在男性恶性肿瘤中高居首位。随着目前我国老龄化加剧,医疗检测技术的进步,环境的改变等因素,前列腺癌在我国呈现明显上升的发病趋势。前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)检测自上世纪90年代应用于临床以来,明显提高了前列腺癌的早期检出率。但随着PSA临床检测技术的广泛应用与研究,暴露出越来越多的检测敏感性和特异性的问题,尤其在PSA 4~10ng/ml的灰区中,这类问题更加凸显。发现一个新的标志物,用以提高前列腺癌早期诊断率,成了当前一个研究热点。在人体中,超过50%的蛋白质有糖基化修饰,这类蛋白也被称之为糖蛋白。在许多肿瘤发生发展过程中,相应的糖蛋白会出现异常糖基化改变。PSA也是一种含糖基化修饰的糖蛋白,他在在Asn-69的N端有一个糖基化修饰位点,目前已有研究表明在前列腺癌与非癌样本的PSA中,N糖存在表达量的差异。但这些研究或仅局限于体外细胞系或局限于人体混合蛋白质样本或所取临床样本数较少。针对这些研究结果存在较大的争议,其结论对于临床诊断没有很好的指导意义。为了更进一步探讨PSA的糖基化对于前列腺癌诊断的临床意义,本课题收集了2015-2016年于上海长海医院泌尿外科就诊并发现前列腺异常改变或PSA升高(大于4ng/ml)的前列腺穿刺病人按摩后前列腺尿液,对于此类患者的PSA糖基化做一个深入研究。二、目的探讨前列腺癌与非癌患者其PSA的糖基化特征,鉴定出PSA的主要N糖基结构,并且评估PSA糖基化在前列腺癌诊断中的临床意义。三、方法(一)患者前列腺按摩后尿液样本及患者信息采集。收集上海长海医院2015-2016年间接受前列腺穿刺的401例样本,随机选取58例患者(29例前列腺癌、29例前列腺增生)按摩后尿液,以及患者相关的年龄、穿刺前血PSA、穿刺病理结果,Gleason评分等信息。根据患者术后穿刺病理将58例样本分为前列腺癌组与对照组。(二)PSA分离纯化、N糖酶切并标记、UPLC-MS检测分析利用免疫沉淀的方法纯化尿液PSA蛋白,并进行聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE),切下相应PSA目标条带。通过糖苷酶PNGase F胶内酶解将N糖分子从纯化的PSA上酶切释放,萃取游离的N糖分子后用Rapi Fluor-MS标记试剂进行标记。以超高效液相色谱(UPLC)、配备荧光检测(FLD)并串联四级杆飞行时间(QTOF)质谱检测系统对PSA的N糖进行液质联用检测分析。(三)N糖定性分析并以外切糖苷酶酶切试验验证鉴定结果将质谱质谱定性分析数据与NIBRT 3.2数据库及Glyco Workbench 2.1数据库匹配后,鉴定出PSA分子N糖类型。用α2-3,6,8,9神经氨酸苷酶酶切已标记的PSA N糖分子,酶切后再次进行UPLC/FLD/ESI-QTOF-MS检测,对比酶切前后检测结果以及数据库糖型分析结果,初步验证了N糖型鉴定结果的准确性。(四)定量数据分析通过FLD色谱峰积分提取相应的定量数据后进行统计学分析,寻找前列腺癌与非癌之间糖基化的差异。并评估不同的差异糖型对临床诊断的意义。四、结果在本课题中,我们鉴定出了28种PSA上不同的N糖糖型,它们中绝大多数呈现双天线复合结构。并且发现PSA上不同糖型含量呈现三种主要的分布模式。从整体糖基分布模型上看,在前列腺癌患者与对照组中,PSA异常糖基化并没有显著差异。但N糖FA2以及FM5A2G2S1,在前列腺癌与非癌患者存在显著的差异。在FA2、FM5A2G2S1及PSA的ROC曲线图中,我们发现三者结合以后对于前列腺癌的预测能力比单独前列腺癌的诊断效能有所提高。另一方面,从FA2在高危患者的分布表达量上看,它在Gleason评分大于等于8分的高级别前列腺癌患者中有明显升高。五、结论PSA蛋白N糖在前列腺癌患者与非癌组之间也存在一定差异。含有N糖FA2的PSA有望成为一种早期诊断高危前列腺癌的诊断标志物。