研究背景与研究目的肺炎链球菌脑膜炎是小儿常见的中枢神经系统感染性疾病,在发展中国家其病死率约为12%～35%,且幸存者中有大约30%发生永久性的神经系统后遗症。尽管有效抗生素的使用使肺炎链球菌脑膜炎的病死率有所下降,但其遗留的神经系统后遗症如精神运动障碍、智力低下、听力损害、癫痫等,仍严重影响着幸存患儿的身心健康。因此,阐明肺炎链球菌脑膜炎的发病机制并以此为依据寻求有效的治疗手段有着极其重大的意义。肺炎链球菌是存在于细胞外的革兰阳性菌,在世界范围内引起高发病率和死亡率的多种疾病。当细菌入侵中枢神经系统时,免疫细胞承担着炎症反应的任务,研究发现常驻的小胶质细胞在病原体入侵时的炎症反应中作用重大。小胶质细胞胞质内表达核苷酸结合寡聚化结构域蛋白-2(nucleotide-binding oligomerization domain 2,NOD2),后者为核苷酸结合寡聚化结构蛋白样受体(NOD like receptor,NLR)家族成员之一,主要功能是作为细菌保守成分——肽聚糖(peptidoglycan,PGN)的细胞内受体,广泛参与细胞内病原微生物的识别和炎症应答的诱导。细菌入侵时,NOD2寡聚化并且募集受体相互作用蛋白-2(receptor-interacting protein 2 kinase,RIP2/RICK/CARDIAK)。RIP2活化后引起蛋白激酶级联反应,引起NF-κB和MAPKs p38的激活。在病原菌感染时,NF-κB和MAPKs p38的同时激活能够迅速诱导促炎反应。作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,转化生长因子激酶-1(transforming growth factor activated kinase-1,TAK1)是NF-κB 和 MAPK信号通路的关键调节因子。研究已证明,在小鼠胚胎成纤维细胞中,TAK1在NOD2诱导的NF-κB信号通路的活化中是必需的。但是,NOD2诱导的NF-1κB信号通路活化的精确分子机制仍在探索中。近期研究发现,自噬作用在感染、免疫、肿瘤、肌细胞功能、细胞凋亡等过程中扮演重要角色。自噬是一种高度保守的细胞内维持细胞稳态的降解再循环系统,在清除细胞内受损、衰老的细胞器以及错误折叠和变性的蛋白质中扮演重要角色。一些病原菌,比如鼠伤寒沙门氏菌、李斯特单胞菌、志贺菌和A族链球菌已被证实能够激活自噬通路。病原体可通过形成双层的吞噬泡而进入自噬体,最终与溶酶体融合从而引起病原体的降解。自噬由多种自噬蛋白相互作用而起始。ATG5、ATG12和LC3/GATE-16/GABA受体相关蛋白对初始自噬泡的形成和自噬小体的成熟至关重要。NOD2在调节肠上皮细胞自噬中的作用已被证实,这一作用与炎症性肠病的发生相关。近期研究发现,RIP2的激活在NOD2介导的自噬过程中是必不可少的。在肺炎链球菌脑膜炎中,NOD2对自噬的调节作用以及二者对炎症的影响仍尚未阐明。为了研究NOD2在肺炎链球菌脑膜炎中的作用及其内在机制,本研究第一部分通过分析肺炎链球菌感染时,NOD2对小胶质细胞炎性因子和自噬作用的影响,并研究了 TAK1-NF-κB信号通路在这一过程中的作用及调控机制,进而解析肺炎链球菌感染后NOD2调节小胶质细胞炎症反应的机制。第二部分通过建立肺炎链球菌脑膜炎动物模型,并检测小鼠神经功能评分、脑组织含水量、病理学改变、炎性因子及自噬蛋白的表达,进一步验证NOD2在肺炎链球菌脑膜炎中的作用。研究方法与研究结果1.第一部分:肺炎链球菌感染时NOD2对小胶质细胞炎性因子和自噬作用的调节及TAK1-NF-κB信号通路的研究。该部分研究所用的实验技术主要为:细胞培养与处理,慢病毒转染,ELISA,RNA提取与逆转录,Real-time PCR,Western blot,免疫荧光等。通过上述实验技术方法研究NOD2如何调节小胶质细胞炎性因子和自噬蛋白的表达以及TAK1-NF-κB信号通路在这一过程中的作用。(1)肺炎链球菌感染时小胶质细胞的炎症反应及NOD2的表达:BV-2小胶质细胞被不同感染复数(MOI=0、25、50、100)的肺炎链球菌感染后,分别在不同的时间点(0小时、4小时、8小时、24小时)通过ELISA方法检测细胞上清液中的TNF-α、IL-6、IL-10、IL-18的水平,通过LDH试剂盒检测LDH的水平。结果显示与非感染组相比,BV-2小胶质细胞被肺炎链球菌(MOI=50)感染后4小时、8小时和24小时,随感染时间的增加TNF-α、IL-6、IL-10、IL-18和LDH的表达均显著升高。与非感染组相比,BV-2小胶质细胞被不同感染复数(MOI=25、50、100)的肺炎链球菌感染后 8 小时,TNF-α、IL-6、IL-10、IL-18和LDH的表达均明显升高,并且细菌浓度越高,炎性因子的表达也越高。同时,我们应用Western blot方法检测了 NOD2在这一过程中的表达。结果显示肺炎链球菌感染时BV-2小胶质细胞中NOD2的表达明显增加,并与感染时间和细菌浓度有一定的相关性,提示NOD2参与肺炎链球菌诱导的小胶质细胞的炎症反应。(2)慢病毒转染shRNA后NOD2表达水平的检测:为研究NOD2蛋白的功能,我们应用慢病毒转染NOD2-shRNA的方法以达到沉默NOD2基因的目的。BV-2小胶质细胞转染NOD2-shRNA后,通过荧光显微镜观察GFP以计算转染效率,72小时后细胞转染效率达(75.24±2.46)%。并通过Real-time PCR的方法检测NOD2在mRNA水平的沉默,慢病毒转染NOD2-shRNA后BV-2小胶质细胞NOD2 mRNA的表达水平显著低于对照组。(3)肺炎链球菌感染时NOD2对小胶质细胞炎症的调节及TAK1-NF-κB信号通路的作用:为研究NOD2在肺炎链球菌诱导的BV-2小胶质细胞炎症中的作用,我们应用慢病毒转染shRNA以沉默NOD2。结果显示肺炎链球菌感染BV-2小胶质细胞后,炎性因子TNF-α、IL-6、IL-10、IL-18和LDH升高的同时,p-TAK1和NF-κB p65的表达也明显增加。经过NOD2 shRNA处理后,NOD2和炎性因子的表达水平明显降低,同时p-TAK1和NF-κB p65的表达降低。为进一步探究TAK1-NF-κB信号通路在NOD2介导的BV-2小胶质细胞炎症反应中的作用,我们应用TAK1抑制剂——5Z-7-oxozeaenol减少TAK1的生成与活化,并检测了应用 NOD2 shRNA 和 5Z-7-oxozeaenol 对 p-TAK1 和 NF-κB p65表达水平的影响。结果显示经NOD2 shRNA和5Z-7-oxozeaenol处理后,TNF-α、IL-6、IL-10、IL-18、LDH 及 p-TAK1、NF-κB p65 的表达均明显降低,进一步证实了在肺炎链球菌感染时,NOD2介导小胶质细胞活化并释放炎性因子,这一过程是通过激活TAK1-NF-κB信号通路来实现的。(4)肺炎链球菌感染时NOD2对小胶质细胞自噬作用的调节:为研究肺炎链球菌能否诱导BV-2小胶质细胞的自噬以及NOD2在这一过程中的作用,我们通过慢病毒转染shRNA以敲除NOD2,并通过Western blot方法测定自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Atg5和Beclinl的表达。结果显示在肺炎链球菌感染后,LC3Ⅱ、Atg5和Beclinl的表达明显升高,而NOD2 shRNA处理后肺炎链球菌诱导的自噬蛋白的表达水平降低。为进一步证实在肺炎链球菌感染时NOD2介导小胶质细胞的自噬作用,我们通过免疫荧光法检测自噬体膜蛋白LC3,当LC3在细胞膜下聚集为斑点状则反映自噬体的形成。我们发现,BV-2小胶质细胞感染肺炎链球菌8小时,LC3从细胞质内散在分布的状态聚集呈特征性的斑点状。另外,NOD2 shRNA处理能够减少LC3自噬体的形成,证实肺炎链球菌感染时,NOD2介导BV-2小胶质细胞自噬作用的激活。(5)肺炎链球菌感染时自噬作用对小胶质细胞炎症的影响:为研究自噬在肺炎链球菌感染中的作用,BV-2小胶质细胞分别用自噬诱导剂雷帕霉素(Rapa)或者抑制剂3-MA处理。结果显示在肺炎链球菌感染时,雷帕霉素能明显降低BV-2小胶质细胞对炎性因子TNF-α、IL-6、IL-10、IL-18和LDH的释放,而3-MA能够增加炎性因子的表达,提示肺炎链球菌感染时,自噬作用有利于小胶质细胞炎性因子的清除。2.第二部分:肺炎链球菌脑膜炎小鼠中NOD2对脑组织炎症和自噬作用的调节。将48只6-8周龄体重20g-24g雄性C57BL/6小鼠,随机分为4组(对照组,肺炎链球菌脑膜炎组,NOD2 shRNA组,NOD2 shRNA+肺炎链球菌脑膜炎组),每组12只。对小鼠侧脑室注射慢病毒以沉默NOD2基因,14天后通过Real-time PCR方法检测NOD2沉默效率,并采用侧脑室注射含肺炎链球菌的细菌悬浮液(1.0×107 CFU/ml)以建立小鼠肺炎链球菌脑膜炎模型。在细菌感染后8小时及24小时分别对小鼠进行神经功能评分;细菌感染24小时后处死小鼠并取脑组织,称重并计算脑组织含水量(脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重X 100%);通过ELISA方法检测脑组织匀浆中TNF-α、IL-6、IL-10和IL-18的表达水平,通过LDH试剂盒检测LDH的水平;对脑组织切片进行HE染色法观察脑膜组织病理改变。为研究小鼠肺炎链球菌脑膜炎中NOD2与自噬的关系,我们通过Western blot方法对脑组织匀浆中NOD2及自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Atg5和Beclin1的表达水平进行测定。(1)慢病毒转染shRNA后NOD2表达水平的检测:为研究NOD2蛋白在肺炎链球菌脑膜炎中的功能,我们应用侧脑室注射慢病毒转染NOD2-shRNA的方法以达到沉默NOD2基因的目的,通过Real-time PCR的方法检测NOD2在mRNA水平的沉默。慢病毒转染NOD2-shRNA 14天后,脑组织匀浆中NOD2 mRNA的表达水平显著低于对照组。(2)小鼠肺炎链球菌脑膜炎模型的建立:小鼠侧脑室注射肺炎链球菌后8小时,留取小鼠脑脊液做细菌培养,证实与接种的为同株肺炎链球菌且有较高的细菌浓度,而对照组小鼠的脑脊液无细菌生长,证实造模成功。(3)临床观察及小鼠神经功能评分:肺炎链球菌感染后8小时及24小时,小鼠均出现神经系统症状,包括自发活动和进食减少、疲劳、嗜睡、共济失调、癫痫发作、昏迷和死亡等,对照组无明显神经系统症状。采用Loeffler神经行为学评分法对小鼠进行评价,结果显示肺炎链球菌感染后8小时和24小时均可引起分值降低,与对照组相比,差异有统计学意义。肺炎链球菌感染后24小时,与肺炎链球菌脑膜炎组相比,NOD2 shRNA+肺炎链球菌脑膜炎组分值明显升高。(4)脑组织含水量测定:肺炎链球菌感染后24小时,小鼠脑组织含水量明显增加,提示脑水肿,而NOD2沉默后脑组织含水量明显降低。(5)脑组织炎性因子测定:肺炎链球菌感染后24小时,小鼠脑组织匀浆中的TNF-α、IL-6、IL-10、IL-18和LDH的表达水平明显增加,而NOD2沉默后炎性因子的表达水平明显降低。(6)脑组织切片HE染色:肺炎链球菌感染后24小时,小鼠脑组织出现明显的中性粒细胞浸润、脑水肿、充血、血管扩张、脑膜破坏等,NOD2沉默后能够减轻上述炎症浸润的病理学改变。(7)脑组织自噬蛋白的表达:肺炎链球菌感染后24小时,小鼠脑组织匀浆中的自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Atg5和Beclin1的表达明显升高,而NOD2沉默后自噬相关蛋白表达明显降低。结论1.肺炎链球菌感染时,NOD2介导BV-2小胶质细胞激活并释放大量炎性因子,这一过程是通过TAK1-NF-κB信号通路的激活来实现的。2.BV-2小胶质细胞的自噬作用可由肺炎链球菌感染所诱发,且NOD2能够介导自噬作用的激活;自噬作用有助于炎性因子的清除。3.在小鼠肺炎链球菌脑膜炎模型中,NOD2介导脑组织炎症的产生,引起小鼠神经功能损伤、脑水肿、脑膜炎症浸润、炎性因子释放等。同时,NOD2能够介导脑组织自噬作用的激活。