栝楼桂枝汤对谷氨酸所致的PC12细胞损伤的保护作用研究

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目的:  观察栝楼桂枝汤(GLGZD)对谷氨酸(Glutamic acid,Glu)诱导的大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)损伤的保护作用的影响,并初步探讨其作用机制,从而为其治疗脑卒中提供理论依据。  方法:  1.谷氨酸(Glu)对PC12细胞的损伤作用:体外培养PC12细胞,取对数生长期的细胞进行试验。设立空白对照组和Glu损伤组(5、10、15、20、25mmol/L),处理24h,四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性,确定最佳浓度。设立空白对照组和最佳Glu浓度组分别培养不同时间(1、2、4、6、8、10h),MTT检测细胞活性,最终确定Glu处理最佳的浓度和时间。光学显微镜观察造模条件下细胞形态和甲瓒的迁移情况。  2.GLGZD对Glu诱导的PC12细胞损伤的保护作用:MTT法测定GLGZD分别孵育PC1224、48 h对细胞活性的影响,确定GLGZD的培养时间;实验分为以下几组:空白对照组,Glu模型组,GLGZD高、中、低剂量组。预先加入含1%FBS的1640培养基,GLGZD高、中、低剂量组培养24h后,加入终浓度为15mmol/L Glu继续孵育6h。MTT法检测PC12细胞生长和增殖活性;光学显微镜观察各组细胞形态;试剂盒测定LDH含量、SOD活性、MDA含量;AnnexinⅤ/PI双染色流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡情况。  3.GLGZD对Glu诱导PC12细胞损伤后细胞凋亡的影响:试剂盒测定Caspase-3活性;采用Western Blot检测各组细胞Bcl-2和Bax蛋白表达情况;采用real-time PCR法检测Bcl-2mRNA、Bax mRNA的表达水平。  结果:  1.用不同剂量的谷氨酸(5、10、15、20、25mmol/L)孵育PC12细胞24h后,发现细胞存活率随着浓度的增加逐渐下降,并且以15 mmol/L的Glu分别培养1、2、4、6、8、10h,结果表明,Glu诱导PC12损伤具有一定的剂量依赖性和时间依赖性。最终,确定谷氨酸模型的条件为15mmol/L孵育细胞6h,此时,细胞存活率约为50%,并且细胞形态和MTT甲瓒颗粒的分布发生了明显改变。  2.用不同浓度(200、400、600、800、1000μg/mL)的GLGZD分别作用PC12细胞24h、48h,发现GLGZD在24h无细胞毒性作用;用GLGZD预先保护后,发现PC12细胞形态得到改善,损伤细胞减少,细胞增殖活性显著提高(p<0.05),LDH释放减少,SOD酶活性升高(p<0.05),MDA含量降低(p<0.05),并且能降低Glu介导PC12细胞的凋亡率。  3.GLGZD处理细胞后,较模型组相比,可显著降低Caspase-3的相对活性(p<0.05),上调Bcl-2/Bax比值(p<0.05),降低Bax mRNA相对表达量,升高Bcl-2 mRNA相对表达量。  结论:  1.GLGZD对Glu诱导PC12细胞损伤有一定的保护作用。  2.GLGZD对Glu诱导PC12细胞损伤的保护作用与其抗细胞凋亡有关。
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