论文部分内容阅读
猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV）所引起的一种急性、高度接触性肠道传染病,主要侵害仔猪,病死率高,危害巨大。PED灭活疫苗和弱毒活疫苗的使用,在一定程度控制了PED的流行和传播,但由于灭活疫苗难以提供黏膜免疫,弱毒活疫苗存在毒力返强且易受母源抗体干扰的问题,迫切需要研制新型疫苗来预防和控制PED。减毒沙门菌活疫苗可诱导产生良好的体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫,可作为口服疫苗载体,以此菌为载体表达异源抗原研制疫苗是防控肠道入侵型病毒的理想疫苗设计策略。本研究将筛选合适的沙门菌作为载体,构建aroA和asd双基因缺失的减毒株,表达PEDV毒株的S1片段,为PED的口服疫苗研发奠定基础。1.猪霍乱沙门菌及孔成道夫生物型菌株生物学特性比较研究选择一株猪霍乱沙门菌（Salmonella Choleraesuis）WG分离株、两株猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型（Salmonella Choleraesuis pore Kunzendorf biotype）CZ-C 和 HY-13 分离株和猪霍乱沙门菌C500疫苗株,开展生长曲线、药物敏感性、抗体效价、定植能力和致病力等方面的评估。生长曲线测定结果显示,HY-13、CZ-C和WG的生长速度显著高于C500,HY-13优势更为明显。药物敏感性结果显示,与C500相比,分离株耐药谱更广。用108 CFU剂量的C500和HY-13灌胃接种免疫小鼠,ELISA检测免疫血清中抗体滴度,免疫后14天到达峰值,21天略有下降,HY-13、CZ-C和WG组均显著高于C500组。定植能力检测结果显示,HY-13的定植量高于其他细菌,且在空肠中的定植量最多,其次是盲肠,肝脏最少。小鼠半数致死量（LD50）的测定结果显示,HY-13 的致病力高于其他菌株。通过对生长性能、定植优势等的综合分析,HY-13 株可作为沙门菌减毒疫苗的候选载体菌。2.表达PEDV S1基因重组猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型减毒株的构建及生物学特性测定首先利用λ-Red同源重组法构建aroA和asd双基因缺失的减毒株HY-1 3ΔaroAΔasd;其次,运用平衡致死系统,将携带asd基因的原核表达载体pYA3334与PEDV截短S1片段重组后电转至HY-13ΔaroAΔasd,构建出重组株HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）。最后,对重组株截短S1蛋白表达水平、生长曲线、致病性、遗传稳定性及体内定植水平等生物学特性进行了测定。PCR及测序结果显示,HY-1 3ΔaroAΔasd与HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）构建成功。Western blot 结果显示,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）成功表达了 PEDV截短S1蛋白。生长曲线结果显示,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）与野生株HY-13均可在不含DAP的LB平板上生长,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）的生长速度略慢于野生株HY-13,但显著快于疫苗株C500。LD50结果显示,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）较野生株HY-13的毒力下降了 100倍左右。遗传稳定性试验结果表明,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）传代50代后仍能够稳定缺失aroA和asd基因且稳定表达截短S1蛋白。体内定植结果显示HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）较野生株HY-13的定植能力有所降低,但仍强于猪霍乱疫苗株C500。3.表达PEDV S1基因重组猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型减毒株的免疫效力评价将 HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）以 108 CFU 剂量灌胃途径免疫 6 周龄 BALB/c小鼠,对其免疫效力进行初步评价。运用ELISA法测定免疫小鼠血清与小肠冲洗液中的抗体水平变化,结果显示,与PBS免疫组和空载体组HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334）相比,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）组可以显著诱导小鼠体内产生针对PEDV的血清IgG和肠黏膜sIgA特异性抗体水平,并在二次免疫后14天达到峰值。PEDV微中和试验结果进一步显示,血清与小肠冲洗液中的抗体均具有PEDV中和特性;在小鼠血清与小肠冲洗液中,与C500组相比,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）均显著产生针对HY-13和C500菌株的特异性血清IgG和肠黏膜sIgA抗体。脏器组织细胞因子表达量测定结果显示,与PBS组相比,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）能够显著增强肠黏膜及脾脏的IFN-γ和IL-4转录表达水平;沙门菌的攻毒保护试验结果显示,一次免疫后14天腹腔注射100倍LD50的WG或HY-13野生株进行攻击,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）和C500免疫组分别可以针对猪霍乱沙门菌孔成道夫生物型和猪霍乱沙门菌产生70%、55.6%和40%、55.6%的保护力。综上结果表明,HY-13ΔaroAΔasd（pYA3334-S1T）可作为同时预防PED和沙门菌病的疫苗候选株。