肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury， I/R)是外科常见的组织器官损伤之一，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等疾患的病理演变过程中起重要作用，死亡率高。肠I/R损伤是多种因素作用的结果，其发病机制极其复杂。近年来的研究表明，补体系统过度活化在肠I/R损伤的发生与展中起着十分重要的作用，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要策略。 在缺血再灌注损伤等补体过度活化的疾病中，坏死的组织细胞、MBL复合物、暴露的抗原和线粒体等通过经典、旁路和MBL三个补体途径共同激活补体。同时，补体活化产物C3a、C5a和C5b-9均参与了组织损伤过程，出现恶性循环。因此，单一的从某一条途径或某一活化产物阻断补体介导的损伤是不够的。在三条补体激活途径中，虽然活化起始点不同，但都在C3处汇合，通过C3转化酶裂解C3，继而形成C5转化酶，裂解C5，活化补体形成攻膜复合物(membrane attack complex，MAC)，因此C3/C5转化酶是理想的抑制靶点。补体受体1型(complement receptor type1，CRl)是由30个短同源重复序列( short consensus repeats，SCR)构成的补体抑制因子，是体内唯一的既对经典、旁路、MBL三个补体激活途径的C3/C5转化酶有加速衰变作用，又有辅助I因子裂解C3b/C4b作用的补体调节蛋白。其中SCR15-18，能结合C3b/C4b，阻碍C3/C5转化酶的形成，辅助I因子裂解C3b/C4b，进而抑制C3/C5转化酶，阻断和抑制C5a及C5b-9等炎症介质的产生，具有抗补体治疗的潜在应用价值。 本研究在我室前期工作的基础上构建CR1-SCR15-18的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中诱导分泌表达目的蛋白CR1-SCR15-18，用Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化表达产物，并观察目的蛋白CR1-SCR15-18在体外抑制补体溶血的活性以及在体内对急性肠I/R损伤的保护作用。研究取得了以下主要结果： 1.根据人CR1-SCR15-18 DNA序列和pPIC9的多克隆酶切位点分别设计一对引物，在上游引物(Pl)通过XholI酶切位点把目的片段连在信号肽序列的后面，下游引物(P2)加入TAG终止密码、6X HIS标签和Not I酶切位点。以pET32a-sCR1-SCR15-18重组质粒为模板，成功扩增了CR1-SCR15-18 DNA片段，片段大小为756 bp。 2.将PCR扩增获得的目的基因片段和pPIC9质粒经Xhol I+Not I双酶切，胶回收后，两者按一定比例用T4连接酶连接，构建重组质粒。重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确，命名为pPIC9-CR1-SCR15-18。 3.SalI线性化pPIC9-CR1-SCR15-18，胶回收后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，经组氨酸营养缺陷型培养基(MD平板)筛选重组酵母菌。经PCR鉴定确认，成功筛选到4个阳性酵母转化子，命名为pPIC9-CR1-SCR15-18/GS115。 4.阳性转化子菌落接种BMGY增菌，换BMMY后在摇瓶水平经甲醇诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Westem blot证实，目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达。 5.CRl-SCR15-18蛋白经Ni2+-NTA柱纯化后，基本无杂蛋白存在，表明采用亲和层析可实现CR1-SCR15-18蛋白的一步快速纯化。纯化干燥后称重，蛋白最终得率为31.8mg/L，为高密度发酵奠定了基础。 6.体外生物活性分析显示，目的蛋白具有抑制补体溶血的活性，随着蛋白浓度的降低，抑制补体溶血的能力随之减弱，目的蛋白抑制补体溶血的活性有量效关系。表明我们制备的重组蛋白在体外有抑制补体活性的功能。 7.成功建立大鼠急性肠I/R动物模型。体内实验发现：I/R组的结果与假手术组的相比，血管通透性增加，MPO活性和MDA含量显著升高，而SOD活性降低，肠组织原位有大量的补体C3组分沉积，病理损伤严重，肠黏膜顶端上皮大片坏死，脱落，大量炎症细胞侵润、黏膜固有层水肿、瘀血、细胞构成增多；与I/R组相比，CR1保护组肠血管通透性显著降低，MPO活性和MDA含量显著降低，而SOD活性升高，肠粘膜组织原位仅有少量补体C3组分的沉积，病理损伤显著减轻。 综上所述：本实验成功构建了CR1-SCR15-18的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中分泌表达了CR1-SCR15-18蛋白，并证实纯化后的CR1-SCR15-18蛋白在体外有抑制补体活性的功能，在体内对大鼠急性肠I/R损伤有抗炎保护作用。为进一步研究补体介导的缺血再灌注损伤、异种器官移植超急性排斥反应等疾病的防治奠定了基础。