第一部分改良反相高效液相色谱-荧光检测法测定情感障碍患者脑脊液和血浆内游离氨基酸水平背景:体液中的氨基酸(amino acid,AA)类神经递质如谷氨酸(glutamic acid,Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)的含量变化有可能成为情感障碍临床诊断的生物学标志。研究者经常选用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定体液内神经活性物质包括氨基酸类物质。离子交换型HPLC(IE-HPLC)在测定低水平游离AA时存在着样本分离时间较长、不能同时分离多种AA,以及样品中许多AA水平低于仪器的检测限等缺陷。反相HPLC(RP-HPLC)偶联高端检测仪器(例如质谱仪)则能显著提高检测的灵敏度。但是,由于质谱仪贵重且需要专业技术人员操作,难以便利地运用到相关临床研究中去。RP-HPLC-荧光检测(FLD)(RP-HPLC-FLD)具有分辨率强、以水相作为流动相的基本组分之一、色谱柱易于平衡等特点被受到广泛应用。但是RP-HPLC-FLD法在测定体液中的氨基酸时也存在着一些不易自动化衍生、分离时间较长以及检测限偏高等不足。因此,我们在本研究中首先基于一项测定大鼠脑组织中Glu、GABA和组胺含量的RP-HPLC程序(在本文中被称为"常规方法")对HPLC的工作条件进行一系列改良,建立了一种稳定而灵敏的适用于较大规模情感障碍患者脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)、血浆等体液中低水平游离AA水平测定的RP-HPLC-FLD方案。我们采用这种方案研究了情感障碍患者(包括重性抑郁障碍(major depressive disorder,MDD)和双向情感障碍(bipolar depression,BD))死亡后脑室CSF中Glu和GABA含量变化特征。方法:针对常规方法,我们主要对RP-HPLC的三方面步骤进行了改进:i)在AA标品或的样品制备(包括除蛋白)阶段,采用硼酸缓冲液代替高氯酸溶解AA标准品或者CSF样品,采用甲醇代替高氯酸去除CSF样品中的蛋白质;ii)在衍生化反应阶段,采用使衍生化反应更加稳定的邻苯二甲醛(O-phthaldialdehyde,OPA)-疏基丙酸代替OPA-Thiofluor;iii)在样品的分离时,采用不含乙腈的醋酸盐缓冲液并添加三乙胺和四氢呋喃的流动相,可以消除拖尾峰和重叠峰,且保持长时间连续测定。采用改良的RP-HPLC-FLD方法分离情感障碍患者CSF和血浆中的氨基酸;采用该改良RP-HPLC-FLD方法测定17例抑郁症患者,包括8例MDD和9例BD以及19例完好匹配的对照者死亡后CSF-Glu和CSF-GABA的含量。结果:采用优化的RP-HPLC-FLD方法在40分钟内获得23种AA标准品的最佳分离。对来自临床的初次诊断未用药临床忧郁型MDD患者的血浆和CSF以及对抑郁症患者死亡后CSF进行23种游离AA的测定,同样获得窄(特异)而高的信号峰。以CSF-Glu和-GABA为例,改良方法的质控参数为最低检测限分别是1pg/μL和0.5pg/μL、最低定量限分别是3.68pg/μL和1.03pg/μL、回收率分别是102.71%和 104.41%、日内差是(1.99-3.82)%和日间差是(3.26-7.83)%。MDD患者CSF-Glu和CSF-GABA的含量显著低于对照组(P≤0.0209),而BD组与对照组相比没有显著变化(P≥0.4030);MDD组的CSF-Glu和CSF-GABA也显著低于 BD 组(两者 P=0.0056)。在对照组内,CSF-Glu(rho=0.826,P=0.000)和 CSF-GABA(rho=0.887,P=0.000)水平均与死后延搁时间(postmortem delay,PMD)呈显著正相关;CFS-GABA(rho=-0.567,P=0.011)与年龄呈显著负相关。CSF-Glu和GABA在对照组未发现显著性别差异(P≥0.422)。结论:优化的RP-HPLC-FLD法适用于检测情感障碍患者体液中低游离AA水平,低水平CSF-Glu和CSF-GABA可能是MDD的临床特征,并可能用于与BD的鉴别诊断。第二部分雌激素膜受体-NO通路对CRH表达的调控机制研究背景:抑郁症在女性高发,WHO已将它列为女性健康的头号威胁。育龄期女性抑郁症发病率是男性的两倍。体内应激反应关键调节系统下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴活性过度亢进被推测是抑郁症临床症候群的神经生物学重要发病机制。我们和其他研究组的研究已经发现,雌激素作为核转录因子刺激下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)因而刺激HPA轴活性,为雌激素参与抑郁症发病机制提供了重要依据。值得注意的是,雌激素除了经典的核受体调节途径,还可以与其膜受体结合而引发下游信号级联反应,影响靶基因转录,也即具有非基因组调节方式。脑内多种分子参与了雌激素的这类调节通路,例如气体性神经调质一氧化氮(NO)不仅在抑郁症发病中扮演重要角色,还有证据显示雌激素-NO通路参与应激反应调节。本部分研究旨在阐明雌激素与其膜受体结合后,如何调控CRH的释放及其基因表达以及一氧化氮合酶(NOS)-NO通路在这种调控机制中的作用。方法:1)在内源性表达CRH、雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)、G蛋白偶联受体30(GPR30)、神经元型一氧化氮合酶(NOS1)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)和内皮型一氧化氮合酶(NOS3)的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH细胞系,采用不同浓度E2-BSA(一种结合BSA的雌激素,仅与细胞膜上的雌激素受体结合,不能进入细胞内)或E2-BSA不同时间刺激SK-N-SH细胞,观察细胞内NO的含量变化、细胞培养液内CRH的释放变化、CRH-mRNA以及ERs和NOS的mRNA表达水平的变化;采用SNP(NO供体)、或采用7-Ni(NOS1的特异性抑制剂)联合E2-BSA作用于SK-N-SH细胞,检测细胞内NO的含量变化、细胞培养液内CRH的含量、CRH-mRNA以及ERs和NOS的mRNA表达水平。此外,本研究还比较E2-BSA与E2刺激SK-N-SH细胞所引起CRH mRNA表达水平改变特征;2)将含人CRH基因启动子的荧光素酶报告基因质粒瞬时转染入HEK293T细胞,24小时后采用E2-BSA刺激细胞,于0分钟、30分钟和24小时的时间点,采用双荧光素酶检测试剂检测人CRH启动子的活性。结果:E2-BSA增加SK-N-SH细胞内NO含量,于0.5小时显著刺激细胞释放CRH,于24小时显著增加CRH-mRNA表达水平。SNP显著刺激SK-N-SH细胞释放CRH,增加CRH-mRNA表达水平。7-Ni抑制E2-BSA对SK-N-SH细胞内NO、CRH释放和CRH-mRNA的刺激作用。E2-BSA在无NOS1的条件下可以上调人CRH启动子活性。结论:E2-BSA与SK-N-SH细胞的膜受体结合,上调细胞内NO表达,刺激CRH的释放并促进CRH-mRNA表达;NOS1-NO并非唯一的通路参与雌激素通过其膜受体刺激CRH活性的调控机制。