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目的:以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,和重金属镉特异性启动子PcadA构建成基因工程重组体导入宿主菌,用于重金属镉的特异性检测。
方法:采用聚合酶链式反应(PCR)从质粒pPcadA上扩增得到重金属镉离子特异性启动子PcadA,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,以大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pNGFP构建了绿色荧光蛋白镉离子诱导表达载体。以枯草芽孢杆菌1A751为宿主菌,采用感受态转化法将表达载体导入1A751,成功构建镉离子检测工程菌株。
分别采用不同种类的金属离子对工程菌株进行诱导试验,通过测定荧光强度考察工程菌株对镉离子的特异性。将工程菌株暴露于不同浓度的二价镉离子(Cd2+)环境中,在一定的时间内测定荧光强度的大小,考察工程菌株对镉离子的敏感性,了解工程菌株对Cd2+的敏感浓度范围及响应时间并考察工程菌株用于快速检测重金属镉的可行性。
结果:从工程菌株中提取的重组质粒pPcadA-gfp通过酶切鉴定、PCR鉴定显示启动子已成功插入载体DNA中,DNA序列分析与预期结果完全一致,说明重组体pPcadA-gfp构建成功。
工程菌株对镉以外的11种重金属离子(As3+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Hg2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+、Sb3+、Sn2+、Zn2+)基本没有响应,仅对Cd2+产生明显的效应,说明工程菌株对镉离子具备较好的特异性。
使用不同浓度的镉在诱导不同时间后观察GFP的表达情况,发现工程菌株对Cd2+的敏感性较好,检测范围为1μM-500μM,在1μM-250μM之间时荧光强度与镉离子的浓度呈正相关。检测下限为1μM,响应时间为15min,在暴露于重金属镉后15min-10hr范围内,工程菌株对敏感浓度内的Cd2+均有很好的响应。
结论:实验表明,该工程菌株能够以绿色荧光蛋白基因为报告基因检测培养体系中最低浓度达1μM的镉离子;利用该菌株有望建立起一种方便快捷的重金属镉的检测方法,有很强的应用价值。