牦牛是牛属动物中唯一能适应高寒气候环境而延续至今的牛种,属珍稀畜种资源和生产性能低的原始牛种,也是世界屋脊的“景观牛种”。为了提高其生产性能,人们一直利用普通牛同牦牛进行种间杂交,获得具有明显杂种优势的一代杂种犏牛。但由于犏牛雄性不育,种间杂交不能达到改良牦牛遗传本质和充分利用牦牛遗传资源的目的,杂种优势的利用和新型牛种的培育均受到了极大的限制,成为牦牛杂交改良的“拦路虎”。近几十年来,为探讨犏牛雄性不育的问题,国内外许多学者对犏牛雄性不育这一复杂的生物现象坐了很多有意义的研究和探讨,但至今尚未找到犏牛雄性不育的主导原因。DAZ基因家族包括DAZ（Deleted in Azoospermia）、DAZL（DAZ-like）和BOULE基因,是精子生成的重要调控因子。DAZL起源于BOULE基因,位于人类2号染色体,BOULE位于人类的3号染色体上,是DAZ基因家族的祖先基因。为了探讨犏牛雄性不育问题,本研究以成年健康雄性黄牛、牦牛和犏牛为研究对象,运用组织切片、RT-PCR克隆测序、Real-time PCR技术、原位杂交技术以及二级结构预测和系统发育分析对DAZL和BOULE基因的组织表达、在睾丸组织中的表达差异水平分析,和BOULE基因在黄牛精子发生中的组织定位,为研究犏牛雄性不育与DAZ基因家族的关系提供理论基础。1.牦牛、犏牛DAZL基因的克隆、序列分析及表达的研究本试验根据黄牛DAZL基因序列EF501823设计引物扩增出牦牛和犏牛全长分别为1772bp、1778bp的序列,两段序列包含完整的ORF编码区,全长为885bp,编码295个氨基酸。生物信息学研究发现,黄牛编码区序列与牦牛和犏牛分别为同源性分别为99.43%、98.31%,与其他动物也具有较高的同源性。含有DAZ家族所具有的典型的RRM结构域、DAZ重复基序,同时在N端还具有高度保守的PABP作用位点和Pumilio-2作用位点,说明脊椎动物的DAZL基因在进化上是高度保守的。系统发育树分析,聚类结果与经典分类学结果基本一致,实时荧光定量PCR显示,DAZL在三种牛睾丸组织中的表达量中,黄牛与牦牛差异显著（P<0.05）,黄牛与犏牛,犏牛与牦牛差异不显著（P>0.05）.推测DAZL基因与犏牛雄性不育无关.2.牦牛、犏牛BOULE基因的克隆、序列分析及表达的研究本试验根据黄牛BOULE基因序列（NM₀01102115）设计引物扩增出牦牛和犏牛的全长分别为1647bp、1650bp,该序列包含完整的编码区,二者也都含有885bp的相同的完整开放阅读框（ORF）,编码一个295个氨基酸蛋白,进行同源性比对,结果发现牦牛、犏牛和黄牛BOULE基因编码区核苷酸序列的同源性为99.85%,氨基酸序列的同源性为98.31%,在编码区内,三个物种共发现了4处碱基差异（0.45／100bp）,与其他动物也具有较高的同源性,也含有DAZ基因家族所具有的典型的RRM结构域、DAZ重复基序。系统发育分析与经典分类结果也基本一致。实时荧光定量PCR显示,BOULE基因在三种牛睾丸组织中的表达量中,黄牛与牦牛差异不显著（P>0.05）,黄牛、牦牛,与犏牛差异显著（P<0.05）。推测BOULE基因与犏牛雄性不育有一定的关系。3.黄牛、牦牛、犏牛睾丸组织学观察和BOULE m RNA在睾丸组织的表达研究制作黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织的的石蜡切片并HE染色发现,黄牛睾丸组织生精小管发育正常,可见各级生精细胞,内有不同时期大量的生精细胞,间质组织和生精小管无间隙小或间隙小,而牦牛睾丸组织生精小管也发育正常,可见各级生精细胞,犏牛睾丸组织生精小管官腔大小及形态不一致,管壁皱缩,生精小管上皮多由1～2层精原细胞构成,有些精原细胞已经死亡,初级精母细胞很少,无次级精母细胞犏牛生精小管由1～2层精原细胞构成,精母细胞少,间质组织与基底膜间隙宽,由组织液填充。原位杂交结果显示,BOULE基因主要分布在初级精母细胞和次级精母细胞中,在其余各级细胞中未发现其表达,推测犏牛精子发生失败,生精细胞凋亡等表象可能与BOULE基因的表达有一定的关系。