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丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）属于黄病毒科（Flaviviridae），肝炎病毒属（Hepacivirus），是引起慢性肝病的主要病原体之一。HCV感染呈全球流行状态，是导致肝硬化和肝癌的最主要病因，约有1.3亿HCV感染者。HCV为单正链RNA病毒，基因组全长约为9.6kb，两端含有5′非编码区（5′UTR）和3′非编码区（3′UTR），中间为一个开放阅读框（ORF）。开放阅读框可编码一个多聚蛋白前体，然后在宿主与病毒蛋白酶的共同作用下加工成为3个结构蛋白和7个非结构蛋白。结构蛋白分别为核心蛋白（Core）、包膜糖蛋白E1和E2，非结构蛋白分别为p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。其中，非结构蛋白NS5B具有RNA依赖的RNA聚合酶（RNAdependent RNApolymerase，RdRp）活性，是HCV RNA合成和复制的关键酶，是抗HCV治疗的关键靶点。随着对病毒基因组复制机制的深入理解，利用RNA病毒的反向遗传技术建立的微小基因组系统为研究HCV的复制、与宿主细胞之间的相互作用、致病机制以及抑制剂的筛选提供了新的工具，进一步为建立HCVNS5B抑制剂的高通量筛选体系提供了技术支撑。因此，本研究利用HCV NS5B的RdRp活性和反向遗传技术，建立可评价HCV NS5B聚合酶活性的新型细胞系统，为HCV NS5B抑制剂的高通量筛选提供新的实验系统。基于目前国内外学者对于HCV复制机理的最新进展，并且以本室前期的研究为基础，首先分别设计并且构建了真核表达质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP、微小基因组(-)5UIRrG(-)3U和真核表达质粒pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U。然后通过将pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pCMV/5UrFI3Urz质粒共转染BHK-21细胞，检测细胞中萤火虫荧光素酶（FLuc）活性，对pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP中NS5B活性进行了验证。通过将pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U和pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP质粒共转染BHK-21细胞，检测细胞培养上清及细胞中的Gaussia荧光素酶（GLuc）活性，对微小基因组(-)5UIRrG(-)3U的功能进行了鉴定。主要研究结果如下：1.成功构建了表达HCV NS3-5B复制复合体的质粒并鉴定了NS5B聚合酶的活性（1）通过PCR方法扩增HCV NS3-5B全长基因片段，然后成功构建了真核表达质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP。酶切鉴定以及测序比对正确后，转染至BHK-21细胞，荧光成像可以观察到绿色荧光蛋白的表达，Western Blot检测结果显示NS3-4A蛋白和NS5B蛋白均在细胞中得到表达。（2）重组质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pCMV/5UrFI3Urz（本室前期构建）共转染至BHK-21细胞中，结果显示所构建的真核表达质粒pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP中的NS5B具有RdRp活性，并且NS3-5B复制复合体中的NS5B活性明显高于单独的NS5B活性。2.成功构建了(-)5UIRrG(-)3U微小基因组并鉴定了其功能（1）设计了一段两端含有HCV负链5′UTR和负链3′UTR序列，中间含有EMCVIRES-DsRed2正向序列和GLuc编码基因的反向互补序列（rvGLuc）的微小基因组片段(-)5UIRrG(-)3U。分别设计扩增各基因片段的上下游引物，然后利用重叠延伸PCR技术将扩增出的各基因片段成功拼接。琼脂糖凝胶电泳结果显示各基因片段大小正确。（2）成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U。酶切鉴定以及测序比对正确后，转染至BHK-21细胞后，红色荧光蛋白得到表达，细胞内重组质粒中的微小基因组具有正常的功能。3.初步建立了评价HCV NS5B聚合酶活性的细胞系统在pCMV-NS3-5B-IRES-EGFP和pcDNA3.1(+)-(-)5UIRrG(-)3U重组质粒共转染的BHK-21细胞中，荧光成像可以观察到绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白同时得到表达，并且位于复制复合体中的NS5B蛋白可以使微小基因组片段进行正常的复制和转录，GLuc得到表达并且分泌至细胞培养液中，进而可以通过检测GLuc的活性来评价NS5B聚合酶的活性。综上所述，本研究成功构建了HCV NS3-5B的真核表达载体和含有报告基因的微小基因组载体，将两者组合初步建立了评价HCV NS5B聚合酶活性的细胞系统。此系统为建立NS5B抑制剂的高通量筛选系统提供了新的途径，并且进一步为利用该系统建立可用于HCV NS5B抑制剂筛选和评价的转基因动物模型提供了实验依据。