川金丝猴耳缘皮肤成纤维细胞特征化及向生殖系诱导的研究

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金丝猴被列为我国Ⅰ级重点保护动物,同时也是我国第二国宝。由于其数量较少,国家出台了相关的法律条例如“森林法”以及“野生动植物保护条例”,并对此做了相关的宣传教育工作,但是川金丝猴依然存在不可忽视的生存压力。目前对川金丝猴的保护研究工作多是从生态学角度出发的宏观方法,关于细胞生物学方面研究相对较少。本研究旨在通过小分子化合物和组织提取液对川金丝猴皮肤成纤维细胞向生殖系细胞进行诱导。  (1)川金丝猴皮肤成纤维细胞的分离、培养与鉴定。细胞形态与成纤维细胞相符,传代后的川金丝猴皮肤成纤维细胞仍然具备良好的细胞活力。利用PCR、流式细胞技术对成纤维细胞以及间充质细胞表面标志基因及蛋白进行检测,标志基因prrx1、twist2、ddr2、runx2、vimentin表达,流式细胞技术检测川金丝猴皮肤成纤维细胞标志物结果发现CD29、CD90的表达量高,CD79等不表达,符合成纤维细胞的细胞类型。结果可以证明分离培养的细胞是成纤维细胞。  (2)利用Tranylcypromine、FSK、repsox、VPA、AM580、EP2004777、Chir99021小分子化合物处理细胞,发现细胞呈现旋涡状生长,部分从梭形变为圆形,对胚外内胚层标志性基因sall4以及gata6进行PCR与qPCR检测,发现其阳性表达,细胞诱导到6d-8d天时qPCR检测发现,gata6的表达水平显著性高于未经处理的对照组细胞(p<0.05),sall4的表达水平极显著高于对照组(p<0.01),说明细胞已经被小分子化合物诱导向胚外内胚层谱系细胞分化。  (3)利用小鼠睾丸组织提取液对小分子化合物处理后的细胞进行了进一步的诱导,诱导57d,在此期间对其进行形态学观察与基因表达检测。结果表明在组织提取液诱导细胞到15d时,vasa水平与sall4的水平都显著高于对照组(p<0.05)。说明前一阶段诱导向胚外内胚层谱系分化的细胞经过小鼠睾丸组织提取液诱导后已经向着生殖谱系细胞分化。  综上所述,本研究成功分离培养了川金丝猴成纤维细胞,川金丝猴成纤维细胞经过小分子化合物与组织提取液诱导,诱导第一阶段小分子可以成功将川金丝猴皮肤成纤维细胞诱导向胚外内胚层谱系细胞分化,诱导第二阶段小鼠睾丸组织提取液可以成功将胚外内胚层谱系细胞诱导向生殖谱系细胞分化。
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