动物细胞培养过程中营养物耗竭和代谢副产物积累的矛盾是限制细胞生长和过程产率的关键。当细胞处于不同的生理状态时，其底物利用率和代谢副产物的生成有显著差别，深入认识细胞的这些生长代谢特性是解决上述矛盾的前提。本文以杂交瘤细胞HB58为研究对象，通过连续流加和灌注培养过程，研究细胞的生长代谢特性和调控规律，为设计优化的培养基组成和灌注策略，建立动物细胞高密度灌注培养过程提供技术手段和科学依据。 本文首先在2L生物反应器中进行了营养物富裕、葡萄糖限制和谷氨酰胺限制的流加培养过程，初步获得了HB58细胞生长代谢的动力学参数：限制培养环境中葡萄糖浓度在1.0mmol/L，以下时，葡萄糖的比消耗速率降低到1.1 mmol/(10<9>cells.day)，比营养物富裕时下降了40％以上；乳酸对葡萄糖的产率降低到0.0063mmol/mmol。限制培养环境中谷氨酰胺浓度在0.050mmol/L以下时，谷氨酰胺的比消耗速率降低到0.28mmol/(10<9>cells．day)，比营养物富裕时下降了56％以上；此时氨的比生成速率从营养物富裕时0.93 mmol/(10<9>cells-day)下降到0.23 mmol/(10<9>cells·day)；丙氨酸不再生成。以上结果初步表明，限制培养环境中葡萄糖和谷氨酰胺的浓度可以提高葡萄糖和谷氨酰胺的利用率，减少有毒副产物乳酸和氨的积累。 在此基础上，设计了近平衡的培养基组成，进行了营养物富裕、葡萄糖限制和谷氨酰胺限制的连续灌注培养实验，以更精确地分析细胞的代谢特性并考察其稳定性。代谢动力学和计量学分析表明：在不同的灌注培养过程中，单抗的比生成速率都在30～40mg/10<9>cells/day之间；在葡萄糖限制时，葡萄糖的比消耗速率降低到0.6mmol/(10<9>cells·day)，只有营养物富裕时的四分之一，乳酸对葡萄糖的产率降到0左右；在谷氨酰胺限制时，谷氨酰胺比消耗速率约为0.26 mmol/(10<9>cells·dayl)，只有营养物富裕时的三分之一，相应地，氨的比生成速率降低到0.20 mmol/(10<9>clls·day)以下，丙氨酸的比生成速率降低到0.034 mmol/(10<9>cells·day)。结果表明，限制培养环境中葡萄糖和谷氨酰胺的浓度在0.20 mmol/L和0.0050 mmol/L以下，可以有效地消除葡萄糖和谷氨酰胺的代谢溢流，提高营养物利用率的同时减少副产物乳酸和氨的积累，有望以最小的灌注速率或培养基消耗支持更高的细胞密度和获得更高的产物浓度。 进一步的代谢流分析发现： 与营养物富裕的灌注培养过程相比，在葡萄糖限制的灌注培养过程中，糖酵解途径流量下降显著；生成乳酸的流量占葡萄糖总代谢流量的比例降低到1.12％以下；葡萄糖代谢经丙酮酸脱氢酶系进入TCA循环的流量变化不大，该反应是限制葡萄糖能量利用率提高和减少乳酸生成的关键步骤。在谷氨酰胺限制的灌注培养过程中，经谷氨酰胺酶脱氨反应的流量和谷氨酸进入TCA循环的流量都下降显著；苹果酸通过穿梭体溢出到丙酮酸的代谢流量显著降低，从营养物富裕稳态下的0.0521mmol C/10<9>cells/h下降到谷氨酰胺限制稳态下的0.0196mmol C/10<9>cells/h；谷氨酸生成丙氨酸的绝对流量和比例都降低。在三种灌注培养过程稳态下，代谢流分析的氨对谷氨酰胺的得率都大于1.0，而代谢动力学计算的结果一般都小于1.0。原因可能是杂交瘤细胞谷氨酰胺代谢产生的氨部分参与了其它合成反应。苹果酸支路的流量一般占谷氨酰胺总流量的30％左右，调控或改造该反应有望开发优化的细胞生理状态，提高谷氨酰胺和大部分氨基酸代谢的利用率，减少有毒副产物氨和丙氨酸、天冬氨酸等非必需氨基酸的生成。另外，实验发现，杂交瘤细胞灌注培养过程存在多态现象，即当培养基、灌注速率和细胞截留率都相同时，经过不同的过渡阶段最终达到了不同的稳态。宏观的代谢动力学计算结果和微观的代谢途径流量及相关酶活力的分析都表明，在不同稳态下细胞的生理状态存在显著差异。最后，根据动力学和计量学参数设计平衡的灌注培养基，采用分阶段提高培养基浓度的方法优化了灌注培养过程。在0.541/day的灌注速率下，最大活细胞密度和单抗浓度分别达到8.3×10<6>cells/ml和380mg/L，活细胞密度和单抗的过程产率分别为批培养的5.5倍和17.8倍。