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背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)继发骨质疏松是RA骨破坏的主要因素之一。以往对于RA或胶原诱导关节炎(collagen induced arthritis,CIA)模型发生骨质疏松的机制研究主要聚焦于破骨细胞(osteoclast,OC)的数量和功能方面。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)具有向成骨细胞(osteoblast,OB)分化的功能,有研究发现RA患者及CIA模型的BMMSCs成骨分化能力异常,可能参与骨质疏松发生。临床观察发现,脐带间充质干细胞(umbilical cord-mesenchymal stem cells,UC-MSCs)移植能够改善难治性RA患者病情。此外,部分RA骨质疏松患者的骨密度(bone mineral density,BMD)也得到改善。因此,我们推测异基因MSCs移植可能通过增强BMMSCs的成骨分化能力和/或抑制骨髓单核细胞(bone marrow monocytes,BMMs)的破骨分化,从而改善RA继发骨质疏松。本研究结果将为异基因MSCs临床治疗RA骨质疏松提供理论依据。目的:观察UC-MSCs移植对CIA小鼠骨质疏松的疗效,探讨UC-MSCs移植对CIA小鼠BMMSCs成骨分化及BMMs破骨分化的调控作用及机制。方法:选取6～8周龄的DBA/1雄性小鼠,于第0天和第21天用牛Ⅱ型胶原(type Ⅱ o1laagen,CⅡ)进行免疫,诱导CIA动物模型。在首次免疫注射后的第28天,CIA模型全部诱导成功,将CIA小鼠随机分为四组,包括CIA对照组、UC-MSCs 移植组、抗肿瘤坏死因子(anti-tumour necrosis factor alpha,anti-TNFα)治疗组和唑来膦酸(zoledronicacid,ZA)治疗组,每组8只。细胞移植治疗组予以5×106数量的UC-MSCs腹腔注射,4周1次,共注射2次。anti-TNFα治疗组每只鼠予以200ug/只的剂量腹腔注射,50ug/只/次,分为4次,每2周1次。ZA治疗组予以150ug/kg的剂量腹腔注射,注射1次。治疗8周后处死所有小鼠。自CIA小鼠发病至治疗结束,每3天进行关节炎评分,观察不同处理对CIA小鼠关节炎的疗效。治疗终点前每组随机选取3只小鼠,行显微CT(micro computed tomography,micro-CT)分析骨组织形态学参数,小鼠处理后取膝关节和股骨,进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H&E)染色,观察骨关节的病理改变。干预8周后处理小鼠,每组随机选取4只,分离、培养BMMSCs,选取培养第2～3代的BMMSCs,诱导成骨分化。在成骨诱导第7天行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和ALP活性测定鉴定成骨分化能力,并分别在成骨诱导的第7和14天提取RNA和蛋白,利用实时定量PCR(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫印迹法(westernblot,WB)检测成骨分化相关因子的表达。同时应用含有骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和/或TNFα的成骨培养基,诱导CIA小鼠的BMMSCs,对照组BMMSCs用常规成骨培养基诱导,在成骨诱导第7天按照上述方法行成骨分化功能检测。每组其余4只小鼠,收集骨髓细胞后,用核因子KB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-KB ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)诱导 OC 生成,诱导第 7 天行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色鉴定OC形成情况,镜下行OC计数并提取RNA,检测破骨相关基因表达水平。结果:治疗终点时,UC-MSCs移植组和anti-TNFα组小鼠的关节炎评分较CIA对照组明显减低(P<0.001),ZA组的关节炎症较对照组无明显改善。Micro-CT和HE染色结果证实,CIA小鼠关节炎发病8周时较对照组DBA/1小鼠出现明显骨质疏松,小鼠的BMD(P<O.01)、骨体积分数(rabecular bone volume/total volume,BV/TV)(P<0.001)和骨小梁数目(trabecular number,Tb.N)(P<0.01)显著下降。UC-MSCs移植后,CIA小鼠的骨质疏松有所改善。小鼠BMMSCs诱导成骨分化结果显示,CIA组ALP活性较DBA/1组减低(P<0.001);UC-MSCs组ALP活性较CIA组显著增强(P<0.001);BMP-2处理CIA组ALP活性较对照组增强(P<0.05)。RT-PCR结果显示CIA组的早期成骨相关基因ALP和Osterix,以及晚期成骨相关基因Ⅰ型胶原(type I collagen,COL-I)mRNA 水平,均较 DBA/1 组低(P<0.05),而 UC-MSCs 组 ALP(P<0.05)、Osterix(P<0.01)、COL-I(P<0.05)基因水平较CIA组升高。WB结果显示CIA组的ALP(P<0.01)和Osterix(P<0.001)蛋白水平低于正常对照组,而UC-MSCs组与CIA对照组比较,ALP(P<0.01)和Osterix(P<0.001)蛋白水平显著增加;anti-TNFα治疗显示出上调ALP和Osterix表达的趋势,但与对照组之间无显著差异;ZA治疗对CIA小鼠BMMSCs成骨分化无明显作用。BMP-2处理组ALP和Osterix的mRNA和蛋白水平均较CIA对照组显著升高(P<0.05);TNFα处理组的ALP和Osterix表达则较对照组有下降趋势。TRAP染色和OC计数结果显示CIA组OC形成较DBA/1组增多(P<0.001),UC-MSCs移植明显抑制了OC生成(P<0.001)。RT-PCR结果显示CIA组的OC分化相关活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)2 的 mRNA 水平较 DBA/1 组高(P<0.01),而 UC-MSCs 移植显著抑制了 NFAT2 的 mRNA 表达(P<0.01);CIA组的骨保护素(osteoprotegerin,OPG)水平较 DBA/1 组低(P<0.05),而 UC-MSCs移植提高了 OPG的mRNA表达(P<0.05)。结论:CIA小鼠随着病程延长会出现骨质疏松,UC-MSCs移植在显著减轻CIA小鼠关节炎症的同时对其骨质疏松也有一定程度改善。CIA小鼠的BMMSCs成骨分化功能较DBA/1组减弱,而BMMs破骨分化较DBA/1组增强。UC-MSCs移植可增强CIA小鼠BMMSCs的成骨分化,并抑制BMMs破骨分化。我们的研究结果提示UC-MSCs可能通过促进成骨分化,抑制破骨分化发挥改善CIA小鼠骨质疏松作用。本研究将为临床应用UC-MSCs治疗类风湿关节炎继发的骨质疏松提供理论依据。