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酵母双杂交是目前研究蛋白质相互作用常用的有效方法,该文试图通过酵母双杂交系统利用tTG作为诱饵筛选HeLa细胞cDNA文库,从而获得能与tTG相互作用的蛋白质的信息,并对筛选获得阳性克隆进行进一步研究.为此我们首先采用SMART cDNA合成试剂盒构建HeLa细胞cDNA,同时改造酵母双杂交载体pACT2,在载体中引入用于和cDNA连接的两个不同的sfi Ⅰ酶切位点.将HeLa细胞cDNA与改造后的pACT2载体经sfiⅠ酶切、连接、电转化大肠杆菌DH5 α后成功构建了以pACT2为载体适合于GAL4酵母双杂交系统筛选的HeLa细胞cDNA文库,对cDNA文库质量检测结果显示大多数克隆中含有cDNA插入片段,cDNA滴度约10<7>,达到构建文库的要求.进一步筛选其中能与tTG相互作用的蛋白质,构建酵母双杂交诱饵质粒pAS2-tTG与HeLa细胞cDNA文库质粒用乙酸锂法共转染酵母菌株AH109,经过SD/-His,-Leu,-Trp,-Ade选择性培养基筛选初步获得240个酵母克隆.通过半乳糖苷酶活性测定和提取酵母质粒再次共转染验证阳性克隆后,最终从240个候选克隆中排除假阳性结果获得9个确定的阳性克隆.提取酵母中pACT2-cDNA质粒经过DNA序列测定,结果显示这9个克隆分别编码TIAR、组织因子(Tissue Factor)、Ribophorin Ⅱ、nucleartransport protein importin α 3部分序列,其中部分克隆为重复克隆.酵母双杂交筛选获得的阳性克隆,其中TIAR是一种与细胞毒性颗粒相关的RNA结合蛋白TIA-1
相关的蛋白质,被称为TIA-1 related protein(TIAR).目前的研究结果表明TIAR与细胞凋亡有关,但其作用机制还不是很清楚.为进一步验证tTG与TIAR的相互作用,RT-PCR法从HeLa细胞中克隆TIAR全长cDNA编码序列后与GST融合蛋白表达载体pGEX4-T-1连接构建TIAR-GST融合蛋白表达质粒,转化大肠杆菌BL21菌株后获得TIAR-GST融合蛋白表达菌株,经IPTG诱导表达后获得TIAR-GST融合蛋白.超声破碎表达菌后,TIAR-GST融合蛋白用Sepharose 4B亲和纯化后并与提取的HeLa细胞总蛋白一起孵育,经GST-pulldown后Western Blot检测结果证实TIAR能与tTG相互作用,并且TIAR与tTG的相互作用需要Ca<2+>的存在,这与tTG催化蛋白质交联的活性特点符合,tTG通过催化蛋白质交联的活性与TIAR相互作用,而TIAR富含谷氨酰胺残基的C端结构域可能含有tTG的作用位点.根据上述结果以及文献报道推测,TIAR在细胞内可能受tTG的转谷氨酰胺作用和磷酸化两种作用机制的调节.