论文部分内容阅读
本研究以三价融合基因Rirol为目的基因，通过农杆菌介导方法转化八棱海棠，以期获得矮化、耐缺铁、抗冷、旱和盐碱的优良转基因苹果砧木。通过研究影响农杆菌介导的八棱海棠遗传转化的因素，优化了八棱海棠遗传转化体系，建立了高效遗传转化体系，获得了携带Rirol基因的苹果砧木新种质。实验内容和研究结果如下： 1．建立了八棱海棠高效的遗传转化体系： 研究了农杆菌菌株类型、vir基因诱导因子、Km加入时间、白化处理及悬浮液pH值对八棱海棠遗传转化的影响，建立了以LBA4404为侵染菌，以MS0+KH2PO40.1mmol／L+1.0％蔗糖+0.5％葡萄糖+1mmol／L脯氨酸+75μmol／L OH-AS pH5.6为悬浮液活化菌株，侵染后叶片放到再生培养基上（MS+BA4.0mg／L+NAA0.2mg／L）共培养两天，然后转入延后培养基（MS+BA4.0mg／L+NAA0.2mg／L+cef 250mg／L），延后到再生苗高2cm时，将苗转入选择培养基（MS+BA4.0mg／L+NAA0.2mg／L+Km50mg／L）进行选择培养的遗传转化体系。实验结果表明，抗性苗出现频率达8.4％。 2．获得了携带Rirol基因的苹果砧木新种质： 在上述体系优化过程中获得了84个卡那霉素抗性转化株系，其中GUS检测阳性的株系有65株。对65株GUS阳性株系中的24个株进行PCR扩增检测，19个株系出现了与阳性质粒相同的条带。随机取5株PCR阳性株系，进行Southern杂交检测，有4个株系出现了杂交条带。PCR检测和Southern杂交检测结果表明，Rirol基因已整合到八棱海棠转化植株的基因组中。对Souther杂交检测呈阳性的4个株系进行RT-PCR检测，4个株系均能扩增出目的条带，表明导入基因已在转录水平表达。对这4个株系进行了耐盐性检测，发现4个转基因株系的耐盐性与对照相比均有不同程度的提高。