随着生物防治技术的不断发展，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在生物防治中的作用愈来愈受到重视。但是人们对于生防菌株的作用机理、生防菌与其靶标菌株以及其寄主植物的关系等的认识还是非常有限。建立稳定、高效、遗传转化体系完善的标记系统，对于更好的发挥生防菌株的作用，了解其在实际应用中的微生态行为，有着非常重要的意义。　　 生防菌枯草芽孢杆菌CQBS03是本实验室从柑橘植株叶面分离到的一株具有广谱拮抗作用的细菌菌株。前期的研究表明枯草芽孢杆菌CQBS03对柑橘溃疡病菌、柑橘青霉、柑橘绿霉、柑橘炭疽菌、柑橘芽枝霉、玉米青枯病菌等多种植物病原菌都有明显的抑制作用。本研究试图应用基因工程技术对生防菌枯草芽孢杆菌CQBS03进行绿色荧光蛋白基因标记，以研究其在柑橘植株叶片上的定殖能力，为利用该菌株进行柑橘溃疡病菌的生物防治奠定基础。　　 研究获得以下主要成果：　　 ①采用重叠PCR方法将p43启动子和gfp进行融合，并与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY300PLK连接，构建了携带gfp基因的重组质粒pHY43G。　　 ②重组质粒以电脉冲转化生防菌株 CQBS03，培养后于荧光显微镜下观察并通过 SDS-PAGE 分析工程菌株 GFP的表达情况。结果显示重组菌能够高效表达GFP，电泳后出现约 29 kDa的绿色荧光蛋白特异条带；在荧光显微镜下可以看到转化菌株产生明显的绿色荧光。证明转化成功，外源的绿色荧光蛋白可以在生防菌株 CQBS03 中高效表达。　　 ③对获得的工程菌株进行了柑橘溃疡病菌的抑菌实验、生长动力学分析、稳定性测试。结果显示，外源质粒对宿主菌的生长未带来明显不利影响，室内平板抑菌实验结果显示 CQBS03-pHY43G 生防效果与出发菌株没有明显差异（P<0.01），质粒稳定性实验表明重组质粒 pHY43G（连续稀释培养 30 代）稳定性为 55％。认为新构建的基因工程菌可以满足作物特定生育期，甚至一年生作物全生育期研究的需要。　　 ④生防菌能否在植株上定殖已成为评价生防菌优劣的一个重要指标。研究采用叶片喷雾方法接种，平皿稀释分离培养方法测定 CQBS03-pHY43G在柑橘叶片上的定殖情况。在柑橘叶片喷施 CQBS03-pHY43G菌株制剂后，定期取样用荧光显微电镜和 PCR 检测回收菌落。结果表明：CQBS03-pHY43G在柑橘叶片上的种群数量为 6.80×104 cfu/g，15天后菌株在柑橘叶片上的种群数量下降到 2.03×　　 104 cfu/g，然后下降速度稍缓；接种后35天柑橘叶片上的工程菌数量下降到较低水平，菌量在 1.73×103 cfu/g。　　 结论：成功获得绿色荧光蛋白标记的生防-枯草芽孢杆菌 CQBS03-pHY43G，该菌株对柑桔溃疡病菌的抑菌作用没有明显改变，稳定性较好，对外源基因表达效率高，可以用于生防菌在田间的定殖和防治机理研究，同时也为高效生防菌株的构建提供了基础菌株和构建方法。