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研究背景随着社会环境和饮食结构的变化,发病率和死亡率在心血管系统疾病中出现逐年上升趋势,而且发病年龄越来越年轻,特别是冠心病(Coronary Heart Disease,CHD)、急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)和心力衰竭(Cardiac Failure,CHF)等是心血管疾病发病率和死亡率增加的主要原因,也是心脏源性猝死的主要病因之一[1]。在发达国家死亡原因最常见的是冠心病[2]。WHO全球统计数据显示由冠心病和循环系统疾病导致的死亡从1999年至2010年已经上升了1/3,而在2015年每死亡3个人中就有一个是由于冠心病[3],因此预防和治疗冠心病成为人类迫切解决的问题。Sirt1近似同种类的酵母沉默信息调节因子2(Silent Information Regulator-2,Sir2),是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD)脱乙酰蛋白酶。Sirtuins有7个家族成员即Sirt1~Sirt7,但是Sirt1一直是被广泛研究的sirtuin蛋白[4]。Sirt1在大脑、心脏、肝脏、胰腺、骨骼肌、脾脏和脂肪组织等身体器官中表达,它存在于细胞核和细胞质中但主要是在细胞核中表达[2]。Sirt1调节的脱乙酰化作用对于许多蛋白质的活性具有重要的作用,调节蛋白质的转录和翻译,蛋白质的翻译在许多生物功能中具有重要的功能,如氧化应激、新陈代谢、细胞增殖和基因组的稳定性[5]。此外,Sirt1一直与老化、代谢疾病、神经退化性疾病、癌症和心血管疾病有关[6]。磷脂酰肌醇-苏氨酸蛋白激酶(Phosphatidyl Inositol 3-kinase/Serine-threomine kinase,PI3k-Akt)信号通路不仅在癌症中具有重要的作用,而且在正常细胞中也具有重要的作用。这条通路在细胞的许多生物学功能中具有重要的作用,如增殖、粘附、迁移、侵入、代谢和存活等[7]。基于上述情况,根据目前国内外有关的研究进展我们提出以下问题:白藜芦醇能否促进Sirt1的表达,并在缺血灌注损伤中保护心肌细胞?Sirt1是否通过上调PI3k-Akt信号通路起到保护心肌细胞的作用呢?研究目标1.观测在缺血再灌注损伤过程中Sirt1是否对心肌细胞有保护作用。2.探讨Sirt1对PI3k-Akt信号通路的影响,明确Sirt1心脏保护作用的发生机制。研究方法1.心肌细胞系(H9c2)随机分为对照组(Control组)和缺氧复氧组(H/R),其中缺氧复氧组分为3组,一组给予含25μM白藜芦醇培养基培养,一组给予含1μM EX527和25μM白藜芦醇培养基,最后一组给予正常培养基,培养2 d-3 d后进行缺氧复氧干预,对照组不做任何处理。2.应用TUNEL免疫荧光染色法,在荧光显微镜下观察各组H9c2心肌细胞系细胞凋亡情况并计算凋亡率。3.应用DHE免疫荧光染色法在荧光显微镜下观察各组心肌细胞的活性氧水平,并计算活性氧比率。4.应用MTT比色法,检测各组心肌细胞的细胞活性。5.采用JC-1免疫荧光染色法,检测各组心肌细胞中线粒体的膜电位,并计算红光与绿光的比值。6.应用抗体免疫荧光检测Sirt1在心肌细胞核中的表达情况。7.采用Western Blotting免疫印迹法检测各组心肌细胞中Sirt1和p-Akt表达情况。8.采用Western Blotting免疫印迹法检测加入Akt特异性抑制剂LY294002后,心肌细胞中Sirt1和p-Akt蛋白的表达水平。研究结果1.与对照组(0.240±0.007)相比,缺氧复氧组(0.487±0.013)凋亡率显著上升(P<0.001);与缺氧复氧组(0.487±0.013)相比,加入Sirt1激动剂白藜芦醇预处理组(0.255±0.010)凋亡率显著降低(P<0.001),而Sirt1抑制剂组(0.569±0.010)凋亡率最高(P<0.001)。2.与对照组(0.222±0.004)相比,缺氧复氧组(0.372±0.020)细胞活性氧水平显著上升(P<0.001),与缺氧复氧组(0.372±0.020)相比,白藜芦醇预处理组(0.256±0.026)活性氧水平显著降低(P<0.001),而EX527组(0.593±0.018)细胞活性氧显著上升(P<0.001)。3.与对照组(0.778±0.007)相比,缺氧复氧组(0.455±0.002)细胞活性显著降低(P<0.001)缺氧复氧组(0.455±0.002)相比,白藜芦醇组(0.587±0.005)细胞活性水平显著上升(P<0.001),EX527组(0.240±0.009)细胞活性水平最低(P<0.001)。4.与对照组(3.822±0.007)相比,缺氧复氧组(2.579±0.006)线粒体膜电位水平显著降低(P<0.001),与缺氧复氧组(2.579±0.006)相比,白藜芦醇组(3.904±0.042)线粒体膜电位显著上升(P<0.001),而EX527组(1.517±0.037)线粒体膜单位水平最低(P<0.001)。5.与对照组(0.333±0.026)相比,白藜芦醇组(0.574±0.018)中Sirt1在细胞核的表达也显著增加(P<0.001)。6.对照组中Sirt和p-Akt相对灰度值分别为(1.697±0.020)和(0.0137±0.0005);缺氧复氧组分别为(2.141±0.015)和(0.0156±0.0004);与对照组相比,缺氧复氧组中Sirt1的表达水平显著降低(P<0.001),而p-Akt蛋白的表达无显著性差异。白藜芦醇组相对灰度值为(3.434±0.010)和(0.0227±0.0009),与缺氧复氧组(2.141±0.015)和(0.0156±0.0004)相比,Sirt1和p-Akt蛋白表达显著上升(P<0.001);EX527组蛋白灰度值为(1.530±0.030)和(0.0120±0.0004),与缺氧复氧组相比Sirt1和p-Akt蛋白的表达水平显著降低(P<0.001)。7.LY294002可以抑制Akt蛋白的表达水平,对照组中p-Akt蛋白的相对灰度值为(2.353±0.059),加入LY294002后p-Akt蛋白的相对灰度值为(1.548±0.021),两组相比具有显著的差异(P<0.001)。加入LY294002后Sirt1蛋白的表达也显著降低,对照组中Sirt1蛋白的相对灰度值为(2.355±0.262),而加入LY294002后Sirt1蛋白的相对灰度值为(1.214±0.151),两组相比具有高度显著差异(P<0.001)。研究结论1.缺氧复氧能成功模拟心肌梗死缺血再灌注损伤心肌细胞系H9c2细胞凋亡率显著上升。2.Sirt1能够减轻H9c2细胞在缺血再灌注中的损伤,其中PI3k-Akt信号通路在Sirt1减轻H9c2缺血再灌注损伤中发挥重要作用。3.该研究为预防和治疗CHD提供新的靶点及重要的理论基础。