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目的： p53蛋白是大家熟知的一个肿瘤抑制蛋白，目前对p53蛋白相关基因的研究主要集中在对p53蛋白促凋亡功能的调节。最近发现了一个新的蛋白家族——p53促凋亡蛋白（apoptosis stimulating protein of p53，ASPP），它有三个成员，即ASPP1、ASPP2、iASPP(（Inhibitory member of the ASPP family），ASPP1、ASPP2能显著性增强p53的促凋亡功能，而iASPP则是p53促凋亡功能的一个抑制子。本次实验利用RT-PCR方法检测ASPP基因家族mRNA在8种肿瘤细胞株的表达水平，揭示ASPP基因家族mRNA的表达量与肿瘤的发生发展的关系，同时了解ASPP基因家族与p53的相互作用机制；利用internet网上免费引物设计对ASPP1与ASPP2基因启动子的CpG岛进行分析并设计甲基化特异性PCR（Methylathen Specific PCR，MSP）引物，同时利用MSP方法检测ASPP1与ASPP2基因启动子甲基化状况，探讨ASPP1与ASPP2在肿瘤细胞中异常表达的原因。 方法： 1．成纤维细胞与肿瘤细胞株HL-60、K562、Jurkat、HCT-116、HT-29、Hepg-2、MCF-7、A549在加有100U／ml青霉素，100U／ml链霉素，10％小牛血清的高糖DMEM培养基，5％CO2条件下37℃培养。 2．应用RT-PCR检测ASPP基因家族mRNA在各细胞株中的表达情况。 3．利用internet网上CpG岛分析软件对ASPP1和ASPP2基因启动子CpG岛进行分析，并利用网上免费引物设计软件MSP3.4设计MSP引物。建立检测ASPP1和ASPP2基因启动子CpG岛甲基化状况的MSP方法。 4．利用MSP方法检测ASPP1与ASPP2基因启动子在p53野生型肿瘤细胞株Hepg-2、MCF-7、A549及成纤维细胞中的甲基化状况。 结果： 1．ASPP基因家族mRNA在各细胞株中均有表达，但其在各细胞株中的表达量有差异。 2．在所有肿瘤细胞株中，ASPP1基因mRNA的表达量明显低于正常细胞（成纤维第三军医大学硕士学位论文细胞、血液单核细胞）的表达量，P<0.01。ASPP:基因mRNA的表达量在不同的肿瘤细胞株中表达差异较大，与正常细胞的表达量相比呈下降趋势，P<0.05。 3.iASPP基因mRNA在不同细胞株中的表达量不同，在A549和HT一29中其表达量与正常细胞无差异，P>O‘05，在其它6种肿瘤细胞株中的表达量均高于正常细胞的表达量，P<0.01。 4.ASPP，和ASPP:基因网上CpG岛分析软件分析得出:ASPP，基因有10个CpG岛，在第一个CpG岛中，平均3 .4个碱基中有一个CG序列;ASPPZ基因有3个CpG岛，在第一个CpG岛中，平均3名3个碱基中有一个CG序列。 5.MSp检测3株p53野生型肿瘤细胞株（A549、HEpG一2、MCF一7）与成纤维细胞的ASPPI和ASPP:基因CPG岛甲基化情况，结果在肿瘤细胞株中ASPP，和ASPP:基因甲基化引物均出现目的基因带，ASPP;和ASPP:基因未甲基化引物均没有出现目的基因带。在成纤维细胞中ASPP，和ASPP:基因甲基化引物均未出现目的基因带，ASPPI和ASPP:基因未甲基化引物均出现目的基因带。 结论: 1.国内首次用RT一PCR方法检测ASPP基因家族mRNA的表达，并发现ASPP基因家族mRNA在所有肿瘤细胞株中均有表达。 2.通过Gel一Pro3.l凝胶图像分析软件对电泳图片半定量分析发现:肿瘤细胞株中ASPP，和ASPPZ基因mRNA的表达量均低于正常细胞，iASPP基因mRNA的表达量均高于正常细胞。结论:在促p53的促细胞凋亡功能中，ASPPI和ASPP:基因为正向调节，iASPP基因为反向调节。甚至在p53突变的肿瘤细胞中ASPP;和ASPP:也能抑制肿瘤细胞生长。 3.首次应用internet对ASPpl和ASpp:基因进行CpG岛分析，并发现ASppl和AsPP:基因在它们的第一个 cpG岛中CG序列含量丰富。表明它们在第一个CpG岛容易发生甲基化。 4.首次应用网上免费引物设计软件MSP3.4设计ASPP，和ASPPZ基因MSP引物，建立检测ASPPI和ASPPZ基因CpG岛甲基化状况的方法—MSP。 5.首次对3株p53野生型肿瘤细胞株（A 549、HEpG一2、MCF一7）和成纤维细胞中ASppl与ASPPZ基因CpG岛甲基化状况检测发现:3株p53野生型肿瘤细胞株中ASPP，与AsPPZ基因CpG岛出现甲基化:成纤维细胞中ASPP，与ASPP:基因CPG岛没有出现甲基化。结果提示:AsPPI与AsPP:基因CpG岛的甲基化状况可能与肿瘤的发生有关。