日本沼虾蜕皮激素受体(EcR)全长cDNA克隆及其在胚胎发育过程中的表达分析

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蜕皮甾类激素除了能够调节甲壳动物的生长、繁殖和周期性蜕皮外,还在卵黄发生及胚胎发生中有着重要的生理作用。蜕皮激素受体(EcR)属于核受体超家族成员,为蜕皮甾类激素的作用受体,它处于甲壳类动物蜕皮及繁殖等生命过程的级连反应启动位置,对完成个体的性别分化、生长发育和性成熟后的繁殖具有十分重要的作用。因而通过分析蜕皮激素受体在胚胎发生中的表达情况就可以从分子水平间接地了解蜕皮甾类激素对胚胎发生的影响。 以日本沼虾(Macrobrachium nipponense)为实验动物,分离了编码EcR的cDNA全长序列,并在mRNA水平对该基因进行了时空表达谱分析。根据Genbank中已报道的其它动物的EcR具有较高保守性的核苷酸序列设计简并引物,通过简并RT-PCR的方法,首先获得EcR572bp的部分cDNA序列。根据该部分序列设计基因特异引物,用RACE扩增获得2549bp的全长cDNA序列,编码了424个氨基酸。该序列与Genbank数据库中已报道的其它物种的EcR氨基酸序列具有60%-88%的同源性,并且具有核受体超家族成员的五域结构特征,包括位于DNA结合域的C4锌指结构,P盒和D盒,以及配体结合域的配体结合袋。将昆虫纲和甲壳纲中已知EcR的物种根据配体结合域的氨基酸序列通过NJ法构建系统进化树,结果表明日本沼虾EcR与甲壳纲物种的EcR在进化上属于同一支,而昆虫纲的EcR则归为另外一支,表明了甲壳纲物种EcR与昆虫纲物种在进化上的不同。通过普通RT-PCR分析EcR mRNA在日本沼虾成体各组织中的表达情况,结果显示在所有检测的组织中均有表达,并且在表膜,眼和卵巢中的表达量相对较高。说明EcR为广泛表达基因,可能在多个组织中参与调控了某些生理反应。 通过实时荧光定量PCR分析Mn-EcR mRNA在胚胎发生各期的表达情况,结果显示从卵裂期到原肠期的表达水平逐渐上升,从前无节幼体期开始至后无节幼体期时表达水平呈显著的增加,并在后无节幼体期时达到最大,随后在前溞状幼体期和溞状幼体期表达水平又显著下降。在胚胎各期的普通RT-PCR检测结果也显示了在后无节幼体期的表达量最高,在前溞状幼体期和溞状幼体期表达量下降。通过原位杂交分析Mn-EcR转录本在胚胎中的表达部位,选取后无节幼体期,前溞状幼体期和溞状幼体期的胚胎作为杂交对象,首先制作了这三个胚胎时期的石蜡切片,然后通过体外转录的地高辛标记的RNA探针进行杂交,结果在三个胚胎时期均有杂交信号被检测到,其中在后无节幼体期的信号最为强烈,且集中在胚胎的分化区,在前溞状幼体期中的杂交信号稍弱,且信号的分布较为分散,而在溞状幼体期的胚胎中,只在胸部附肢,尾节和腹部的表皮和复眼膜处有杂交信号。 综合在胚胎中的荧光定量PCR、普通RT-PCR和原位杂交三个实验的结果来看,Mn-EcR在日本沼虾所有胚胎发生时期均有表达,并且在后无节幼体期的表达最为显著。由此推测蜕皮甾类激素在日本沼虾胚胎发生各期均参与调控了与该期胚胎发育相关的某些生理反应,并且随着胚胎发生的进行,蜕皮甾类激素的滴度在相应的升高。本研究为首次从分子水平研究EcR在胚胎发生中的表达情况,为进一步研究蜕皮甾类激素对胚胎发生的影响奠定了初步的分子基础。并通过分析其氨基酸序列特征,为在蛋白水平进一步对甲壳动物EcR进行分析,诸如特异性抗体的制作等奠定了理论基础。
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