论文部分内容阅读
稻瘟病(Rice blast)是危害水稻最重要的病害之一,给我国西南地区每年的水稻生产造成巨大的损失。目前化学防治仍是防治水稻稻瘟病的主要方式,然而长期广泛的使用化学药剂会导致抗药性的产生。本研究在2013-2014年间通过对贵川渝18个区县水稻稻瘟病采样,共分离获得了902株稻瘟病菌(Magnaporthe grisea(Hebert)Barr)。通过监测采样地区稻瘟病菌对稻瘟灵和吡唑醚菌酯的抗性,发现已经出现了稻瘟病菌对稻瘟灵(Isoprothiolane)的低抗性菌株。室内人工诱导筛选,成功的获得了稻瘟病菌对吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)的高抗性突变体,并对突变体的主要生物学特性、抗性机理以及交互抗性进行研究。1.稻瘟病菌对稻瘟灵的敏感性基线及抗药性监测：采用菌丝生长速率法测定2013年分离自川渝地区100个稻瘟病菌野生单孢菌株对稻瘟灵的敏感性,结果表明其EC5o值在0.8746-8.1430 μg/mL之间,最不敏感菌株的ECso是最敏感的9.3倍,不同敏感性的菌株分布频率呈连续的单峰曲线分布,平均EC5o值为3.0764±1.5909 μg/mL,最低抑制浓度 (Minimal inhibition concentration,MIC)≤45μg/mL。根据以上研究结果,确定以3.0764±1.5909μg/mL作为西南地区稻瘟病菌对稻瘟灵的敏感性基线；确定以50 μg/mL作为稻瘟病菌对稻瘟灵的抗药性监测区分剂量,并以此剂量监测各地稻瘟病菌对稻瘟灵的抗性,结果发现1株来自重庆市涪陵区龙潭镇寿坝村的稻瘟病菌对稻瘟灵有低抗性,经测定其抗性指数为3.13。2.稻瘟病菌稻瘟灵室内抗性突变体的遗传稳定性：通过室内稻瘟灵对稻瘟病菌药剂驯化,获得了5个中抗突变体和1个高抗突变体。测定这些突变体在无药剂选择压力培养8代后对药剂的敏感性,结果它们对稻瘟灵均变为敏感,表明它们的抗药性不能稳定遗传。由于未能获得稳定抗稻瘟灵的稻瘟病菌突变体,所以未能进一步研究分析稻瘟病菌对稻瘟灵的抗药性机理。3.稻瘟病菌对吡唑醚菌酯的敏感性基线及抗药性监测：采用菌丝生长速率法测定了2013年分离自川渝地区100个稻瘟病菌野生单孢菌株对毗唑醚菌酯的敏感性,结果表明其ECso值在0.00313-0.02448 μg/mL之间,最不敏感菌株的EC5o是最敏感的7.8倍,不同敏感性的菌株分布频率呈连续的单峰曲线分布,平均EC50值为0.00917±0.00385 μg/mL,MIC≤0.8μg/mL。根据以上研究结果,确定以0.00917±0.00385 μg/mL作为西南地区稻瘟病菌对吡唑醚菌酯的敏感性基线：确定以1.0μg/mL作为稻瘟病菌对吡唑醚菌酯的抗药性监测区分剂量,并以此剂量监测各地稻瘟病菌对吡唑醚菌酯的抗性,结果表明所测菌株均为敏感菌株,未发现田间抗性菌株。4.稻瘟病菌对吡唑醚菌酯抗性突变体及主要生物学特性：通过室内吡唑醚菌酯对稻瘟病菌药剂驯化,获得了3个中抗突变体和1个高抗突变体。将这些菌株在无药剂选择压力下连续培养8代后,抗性突变体PYC40-Mut对吡唑醚菌酯的抗性水平依然保持在高抗水平,表明其抗药性可以稳定地遗传；另3个突变体的抗药性水平下降为敏感,因此以PYC40-Mut作为后续研究材料。PYC40-Mut敏感性测定表明,其对吡唑醚菌酯的EC50值为2.7383 μg/mL,抗性倍数为370倍,为高抗药性突变体。PYC40-Mut生物学特性测试结果表明,其单孢后代对吡唑醚菌酯敏感性与亲本菌株无显著性差异；离体适合度、活体适合度和综合适合度与亲本菌株相比均显著下降。5.稻瘟菌对吡唑醚菌酯的抗性机理：用CTAB法提取PYC40-Mut和其亲本菌株PYC40的基因组DNA,以引物Pgcytb-F 1 (5’-AGTCCTAGTGTAATGGAAGC-3’)和Pgcytb-R1 (5’-ATC TTCAACGTGTTTAGCACC-3’)对Cyt b基因进行PCR扩增,分别获得了PYC40-Mut和PYC40菌株Cyt b基因的部分碱基序列,测序比对发现PYC40-Mut有一处碱基位点发生改变,其Cyt b基因428位碱基由鸟嘌呤(G)突变成为胞嘧啶(C),导致其相应的143位氨基酸由甘氨酸(G)突变为丙氨酸(A),这可能是PYC40-Mut菌株对吡唑醚菌酯产生抗性的机理。6.交互抗性：稻瘟病菌吡唑醚菌酯抗性菌株平板交互抗性测定结果表明,吡唑醚菌酯与甲氧基丙烯酸酯类(Strobilurins)杀菌剂醚菌酯(Kresoxim-methy)和嘧菌酯(Azoxystrobin)之间存在正交互抗性,而与甾醇类的苯醚甲环唑(Difenoconazole)、三唑类的戊唑醇(Tebuconazloe)、黑色素合成抑制剂类的三环唑(Tricyclazole)和有机杂环类的稻瘟灵之间无交互抗性。以上研究结果表明,本研究在抗药性监测过程中,虽然发现了对稻瘟灵的抗性菌株,但其抗性程度较低,抗性频率也不高,因此稻瘟灵依旧可以作为我国西南地区防治稻瘟病的药剂,但在出现抗性菌株的地区应该将稻瘟灵和其它药剂的轮换使用。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂属于抗药性产生的高风险杀菌剂,本研究通过室药剂驯化成功的获得了稻瘟病菌对吡唑醚菌酯的高抗性突变体。所获得的突变体对甲氧基丙烯酸酯类的醚菌酯和嘧菌酯具有交互抗性。因此在今后的田间用药过程中应避免甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂之间的交叉使用,以预防抗药性稻瘟病菌的产生。