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目的： 研究临床分离大肠埃希菌中稀有β-内酰胺酶基因的识别及其耐药特性、基因定位和阳性菌株的流行病学调查，为有效防治β-内酰胺酶基因耐药性的形成和播散提供实验依据和抗菌药物的合理使用提供指导。 方法： 1.以2009年-2011年间温州医科大学附属第一医院临床分离的大肠埃希菌为研究样本，采用SDS法提取细菌基因组DNA，送交中科院北京基因组研究所进行solexa测序。 2.将样本测序所得到的短序列进行拼接和注释，从GenBank数据库和ARDB中收集到的β-内酰胺酶耐药基因作为参考序列，对测序读长进行mapping，得到各基因在大肠埃希菌测序序列中的丰度。 3.选取4个稀有β-内酰胺酶耐药基因，设计特异性引物通过PCR方法来检测499株大肠埃希菌中4个稀有β-内酰胺酶耐药基因的分布情况，PCR产物测序确定阳性菌株。 4.对筛选的阳性大肠埃希菌菌株进行体外敏感性试验来判断耐药性。 5.将阳性基因扩增进行分子克隆及克隆菌株体外敏感性试验判断4个稀有β-内酰胺酶耐药基因ORF的耐药特性。 6.根据克隆菌株ORF测序序列进行BLAST比对和MEGA6.06软件分析不同的SNPs导致的氨基酸变异。 7.利用携带稀有β-内酰胺酶耐药基因的阳性菌株与受体菌EC600的接合转移试验来研究基因及其质粒的水平转移能力，对阳性接合子进行PCR验证稀有β-内酰胺酶基因，并检测阳性接合子的体外药敏情况。 8.利用特异性探针进行Southern blot来确定稀有β-内酰胺酶耐药基因存在于质粒上还是非质粒上（染色体上）的定位分析。 9.利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行稀有β-内酰胺酶耐药基因阳性大肠埃希菌菌株间的同源性分析来研究耐药菌株的流行特征。 结果： 1.从β-内酰胺酶耐药基因丰度图中可以看出在大肠埃希菌中存在不同程度的β-内酰胺酶耐药基因，其中blaTEM、blaOXA、blaCT X-M-9和blaCT X-M-1这四个基因型的平均丰度很高，而blaDHA、blaSHV, blaBIL和blaKLUC平均丰度很低，大都已经被报道过并也存在于大肠埃希菌中，但是报道的数量不多。 2.筛选共有21株阳性大肠埃希菌:单株携带单个blaKLUC、 blaBIL、blaDHA和blaSHV分别有5株、8株、4株和2株;共同携带blaKLUC和blaSHV有1株，共同携带blaDHA和blaSHV有2株。21株对β-内酰胺类有不同程度的耐药，其中对广谱青霉素类（氨苄西林-81％、哌拉西林-66.7％）和第三代头孢菌素（头孢唑啉-81％、头孢他啶-81％和头孢曲松-66.7％）较高的耐药率。 3.共得到20株ORF克隆菌株（其中4株blaKLUC,8株blaBIL（blaCMY）、4株blaDHA和4株blaSHV克隆菌株）并进行体外药敏性试验，发现各基因ORF有着不同的耐药特性，其中有1株blaKLUC、4株blaBIL和4株blaDHA都无抗性，剩余11株克隆菌株都有抗性，这是由于氨基酸位点的不同导致了药物的抗性不同。并发现了1株新亚型blaKLUC、5株新亚型blaCMY、4株新亚型blaDHA、1株新亚型blaSHV。 4.接合转移实验成功得到了1株携带blaKLUC的接合子J-D2716、3株各自携带blaCMY的接合子J-D2308、J-D2382、J-D2735以及1株都共同携带bla SHV-5和blaDHA的接合子J-D2485和1株共同携带blaSHV-5和blaDHA的D2487只检测出携带blaSHV-5的接合子J-D2487。 5.将21株阳性野生菌株和6株接合子进行Southern blot，其结果与接合转移实验结果一致，除了一株D2417阳性野生菌携带的新亚型blaCMY的Southern blot结果阳性，但未能接合转移成功，说明该6株接合子携带的各自稀有β-内酰胺酶基因位于各自约23kb大小的可转移性质粒上，而D2417携带的新亚型blaCMY坐落在不可转移的23kb的质粒上，其它剩余的可能位于各自菌株的染色体上。 6.在21株阳性稀有β-内酰胺酶耐药基因的大肠埃希菌中，有17个PFGE型，有3个无PFGE。其中只有共同携带不同新型基因型blaDHA和相同blaSHV-5的两株2010年菌株D2485和D2487为同一个PFGE型，即相同克隆型，表明此两株菌株在2010年存在小范围的克隆播散，而其它菌株都为不同的PFGE型，表明稀有β-内酰胺酶耐药基因的大肠埃希菌总体上不是由于克隆播散引起的。 结论： 1.大肠埃希菌中稀有β-内酰胺酶耐药基因的低阳性检出率与高通量测序技术以及生物信息学技术得到的丰度图结果较为一致，这使我们能够在短时间内利用核酸序列，来探索基因结构与病原菌耐药性的关系，对于致病菌中耐药基因的分布及新基因的发掘和功能研究起着极为有效的作用，为新药的研制与开发提供了新的思路。 2.碳青霉烯类药物可用于临床大肠埃希菌感染性疾病的治疗。 3.在21株阳性稀有β-内酰胺酶耐药基因的大肠埃希菌中，有17个PFGE型，有3个无PFGE。只有2010年的两株菌株D2485和D2487为同一个PFGE型，说明此两株菌株在2010年存在小范围的克隆播散，而三年间稀有β-内酰胺酶耐药基因的大肠埃希菌总体上不是由于克隆播散引起的，且也体现了遗传背景的多样性。 4.发现较多的新型基因型，进一步证明了高通量测序以及生物信息学技术能够发现一些与已知基因同源性很高的新型耐药基因型。 5.接合转移实验和Southern blot实验共同揭示了基因的定位与质粒的可转移性。 6.blaSHV-5 ORF是这些基因中对β-内酰胺类抗生素具有最多的多种药物耐药的基因型，Gly238Ser和Glu240Lys突变对氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林、头孢噻肟和氨曲南耐药，blaSHV中Ser133Gly新位点只对氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林耐药;blaCMY(blaBIL)Va1231Ser、Asp301Gly两个新位点突变对氨苄西林由耐药变成了敏感，对头孢唑啉由中度耐药变成了耐药，而Glu81 Gly、Val368Ile、Glu115 Gly、Ile356Thr、Tyr60His新位点突变能够使药物敏感性都增加使得都无抗性;而blaKLUC-5在162新位点突变成了终止密码子使得无抗性。