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脂联素(Adiponetin)是动物和人体脂肪细胞分泌的一种细胞因子。研究表明,脂联素能够调控动物和人体的能量稳态、葡萄糖代谢和脂肪代谢,是与脂肪沉积呈负相关的脂肪细胞特异性蛋白。
猪是脂肪沉积型动物,不同品种之间脂肪沉积能力差异很大,特别是我省的地方优良品系,如蓝塘猪和大花白,其肉质和口感好,但脂肪沉积比瘦肉型猪高很多。通过脂联素调节猪只脂肪代谢,提高瘦肉率,是一种安全可靠的方法,有可能为从根本上杜绝“瘦肉精”(盐酸克伦特罗,Clenbuterol)的使用提供技术支持或替代品。
本研究从猪脂肪组织总RNA中克隆获得了猪全长脂联素Ad基因,并进行测序比对;设计适当的引物,从全长脂联素Ad基因中克隆获得猪脂联素球状结构域gAd基因,并引入相应的酶切位点和His-tag,把gAd基因插入表达载体pNZ8048;将鉴定正确的重组质粒pNZ8048-gAd转化到乳酸乳球菌(Lactobacilluslactis)NZ9000中诱导表达,SDS-PAGE表明成功表达相对分子量约17kD的蛋白质。
通过Ni2+亲和层析柱对重组gAd蛋白进行纯化,得到单一的gAd蛋白条带,纯度高。用鼠源Anti-His抗体和本研究制备的鼠源抗gAd血清进行Westemblotting检测,证明gAd蛋白为带有His-tag的融合蛋白,并且可与制备的抗血清结合,具有反应原性。对重组乳酸乳球菌NZ9000-gAd诱导表达条件进行优化,获得较高的gAd蛋白表达量。
将经纯化的gAd蛋白通过鼠尾静脉注射到高糖高脂饲喂的小鼠体内,分别测定血清葡萄糖(PGL)和血清甘油三酯(PTG)。与注射生理盐水的对照组比较,实验组小鼠PGL在2h后开始明显降低,在2h和3h分别比对照组降低了20.42％和34.00%,差异具有显著意义(n=5,P＜0.05),这显示gAd蛋白具有加快糖代谢、降低PGL的作用。但是两组的PTG差异不显著(P＞0.05)。
蓝塘猪动物临床试验设置了对照组1(不注射),以及对照组2(颈静脉注射生理盐水)及实验组(颈静脉注射重组gAd蛋白),分别取0h～4h血清进行测定。两个对照组之间的PGL、PTG、血清游离脂肪酸(FFA)水平差异不显著(P＞0.05)。实验组蓝塘猪PGL在2h时比对照组1和对照组2分别降低了25.65%和24.17%(n=3,P＜0.05);在3h时比对照组1和对照组2分别降低了25.69%和21.90%(n=3,P＜0.05)。实验组PTG在2h3h时比对照组1和对照组2分别降低了52.35%和49.96%(n=3,P＜0.05);在4h时具有极显著性差异,比对照组1和对照组2分别降低了41.09%和46.58%(n=3,P＜0.01)。实验组蓝塘猪FFA在3h时比对照组1和对照组2分别降低了30.78%(n=3,P＜0.05),比对照组2降低了21.07%,具有极显著差异(n=3,P＜0.01);在4h时实验组比对照组2降低了16.60%(n=3,P＜0.05),但是与对照组1的差异不显著(P＞0.05)。以上结果表明重组gAd蛋白具有降低蓝塘猪PGL、PTG、FFA的活性。
本研究成功构建了含有的猪脂联素球状结构域gAd的重组乳酸乳球菌,并且证明了重组的gAd蛋白具有生物活性。这表明有可能从动物生理角度调节猪脂肪代谢,减少脂肪沉积,提高我国地方优良猪种的养殖经济效益;另外,通过脂联素调节猪只脂肪代谢,无药残或毒害作用。所以该研究的成功实施,将从多方面提高肉类食品安全性,具有显著的社会和经济效益。