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冬凌草甲素是从香茶菜属(Isodon)许多植物中分离出来的一种贝壳杉烷二萜类(ent-kaurene diterpenoid)化合物,药理学研究发现,该成分由于具有较强的抗癌和抗肿瘤活性,有望开发成为一种新型的抗肿瘤和抗癌药物。冬凌草甲素的药代动力学和排泄研究结果表明,冬凌草甲素在体内发生明显的生物转化。药物代谢研究是新药研究的重要组成部分,因此,有必要对冬凌草甲素的代谢进行研究,为进一步的药理、毒理研究提供必要的前期研究数据。本文采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技术,鉴定大鼠口服冬凌草甲素后尿液及胆汁中的代谢物,研究了冬凌草甲素在大鼠体内的代谢情况,总结了冬凌草甲素在体内代谢物的质谱裂解规律,并推测了可能的代谢途径。蓝萼香茶菜为香茶菜属植物蓝萼香茶菜(Isodon japonica var.glaucocalyx(Maxim.)Hara)的干燥全草或叶。临床上主要用于治疗咽喉肿痛、扁桃体炎、胃炎、乳腺炎、肝炎和感冒发热等症。蓝萼香茶菜在我国分布广泛,且香茶菜属许多植物外观类似,市场上该药材植物基源混乱,且不同产地、不同采收季节和不同用药部位的蓝萼香茶菜的化学成分存在明显差异。因此,控制和鉴定蓝萼香茶菜中主要的有效成分对于药材的质量评价十分重要。本研究建立了液质(HPLC-ESI-MS/MS)联用法同时测定了蓝萼香茶菜药材中8种二萜类化学成分的含量,并采用主成分分析法对不同来源不同部位的蓝萼香茶菜进行质量分析,为蓝萼香茶菜药材的质量控制提供科学依据。同时为了更加准确、全面的、科学客观地了解蓝萼香茶菜中含有的微量二萜类化合物,同时采用UPLC-Q-TOF-MS/MS法对药材中二萜类成分进行了快速鉴别和结构分析,从而为全面深入研究中药活性成分与中药药效的相关性奠定基础。第一部分UPLC-Q-TOF-MS/MS法鉴定冬凌草甲素大鼠体内代谢物目的:采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术鉴定大鼠口服给予冬凌草甲素后尿液和胆汁中代谢物,同时研究冬凌草甲素在大鼠体内的代谢物类型,阐明冬凌草甲素体内的代谢途径。方法:大鼠灌胃给予冬凌草甲素后,收集大鼠的尿液和胆汁,经液-液萃取进行分离纯化前处理。首先采用uplc-q-tof-ms/ms技术,esi源,负离子模式,全扫描结合多重质量亏损(mmdf)和动态背景扣除(dbs)的方法进行数据采集,同时触发信息依赖采集(ida),每一循环采集8个响应最强峰的二级质谱图来分析样品,然后采用多种数据后处理方法进行代谢物的筛选,包括提取离子(xic),质量亏损过滤(mdf),子离子过滤(pif),中性过滤(nlf)等进行数据处理,获得代谢物的精确分子质量、元素组成和二级质谱图,最后基于精确质量数、相关的生物代谢转化规律和母药化合物的裂解规律,对冬凌草甲素可能的代谢产物进行结构推测,对代谢物中存在的同分异构体利用clogp值辅助进行区分。色谱柱为菲罗门kinetexc18柱(100mm×2.1mm,2.6μm),柱温为25oc,流动相为甲醇和0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱,流速为0.4ml/min,进样体积为5μl,运行时间为15min。结果:本研究使用uplc-q-tof-ms/ms技术共鉴定冬凌草甲素在大鼠体内的18个代谢产物(一相代谢物16个,二相代谢物2个),其中尿液中发现10个代谢物,胆汁中发现17个代谢物。研究结果显示,冬凌草甲素的主要代谢途径是还原反应和氧化反应,其中羟基和碳碳双键是反应的主要位点。二相代谢反应主要是葡萄糖醛酸反应。结论:本研究采用uplc-q-tof-ms/ms技术,首次成功发现和鉴定了冬凌草甲素大鼠体内代谢物,为冬凌草甲素在体内过程的阐明和药理学研究奠定了基础。该方法快速、灵敏度高、分辨率高,可用于其他单体成分和中药材进入体内的成分分析。第二部分液质联用法同时测定蓝萼香茶菜中8种二萜类成分及其主成分分析目的:建立一种高效液相色谱串联三重四级杆质谱法(hplc-esi-ms/ms)同时测定蓝萼香茶菜中河北冬凌草素k、冬凌草乙素、延命草醇、拉西多宁、henryin、蓝萼甲素、冬凌草甲素和牛尾草素a8种二萜类的含量,并用于不同来源蓝萼香茶菜的质量分析,同时采用主成分分析法(pca)找出影响药材质量的主要因素。方法:采用多反应监测(mrm)模式同时监测蓝萼香茶菜中8种二萜类化学成分。esi源,负离子监测模式,源喷射电压为-4500v,离子源温度为650℃。雾化气(gas1):40psi,加热气(gas2):50psi,帘气:25psi。8种被测成分的监测离子对分别为:河北冬凌草素k365.2/317.2,冬凌草乙素361.3/343.2,延命草醇365.2/347.2,拉西多宁363.2/197.0,henryin391.2/58.9,蓝萼甲素331.0/313.0,冬凌草甲素363.2/345.1和牛尾草素a363.2/255.1。色谱柱为agilentzorbaxsb-c18(4.6mm×250mm,5μm),流动相为甲醇-水,梯度洗脱,流速0.8ml/min,柱温25℃。采用该法对31批蓝萼香茶菜中8种二萜进行了测定,并采用pca找出了影响蓝萼香茶菜质量的主要化学成分。结果:被测8种二萜类成分的峰面积和浓度在测定浓度范围内均呈良好的线性关系,仪器重复性、日内和日间精密度、稳定性、检测限和定量限均符合要求。平均加样回收率为93.45-103.3%,rsd小于5.6%。测定结果表明,产地、生长环境、采收时间和用药部位等因素均对8种活性成分的含量有影响,蓝萼甲素和henryin含量最高,被认为是影响其质量的主要活性成分。pca得分散点图表明,31批样品被明显的聚为两大类,表明产地对药材的质量差异会产生一定的影响。结论:该方法操作方便、简单快速、专属性强、灵敏度高、结果准确可靠,可用于蓝萼香茶菜药材中多种二萜类成分的同时定量测定。同时,pca法可为蓝萼香茶菜药材分类和质量评价提供依据,为节约药材资源及合理用药提供借鉴和参考。第三部分基于uplc-q-tof-ms/ms和模板过滤技术快速识别和鉴定蓝萼香茶菜中二萜类成分目的:总结二萜类化学成分的电喷雾质谱裂解规律,采用uplc-q-tof-ms/ms技术,建立快速识别和鉴定蓝萼香茶菜中的微量二萜类成分的方法。方法:首先采用uplc-q-tof-ms/ms技术,通过电喷雾离子源负离子模式下一级质谱扫描、母离子扫描和子离子扫描,研究了8个具有代表性的对映-贝壳杉二萜类成分对照品的质谱裂解途径,并总结其规律。然后对蓝萼香茶菜提取液在负离子模式下进行tof-ms-ida-8ms/ms扫描,获得全扫描质量色谱图。然后利用自建过滤模板结合多种数据后处理技术,筛选和鉴定蓝萼香茶菜中二萜类化学成分。色谱柱为Phenomenex Kinetex C18(100 mm×2.1 mm,2.6μm)色谱柱,柱前接有在线过滤器,柱温25℃,流动相为水和甲醇溶液,梯度洗脱,流速0.3 mL/min,进样量为2μL。结果:通过电喷雾离子源负离子模式一级质谱扫描、母离子扫描和子离子扫描,总结出蓝萼香茶菜中8个二萜类成分(4个不同母核亚型)质谱裂解规律。据此采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术首次鉴定出不同批次蓝萼香茶菜提取物中24个化学成分,其中8个化合物与对照品的保留时间和二级质谱信息比对可确证其化学结构,其余16个化合物通过“Chemspider”和“Master View”中的XIC功能提供的信息进行鉴定,误差范围在±3 ppm之内。结论:所建的UPLC-Q-TOF-MS/MS结合模板识别过滤技术方法灵敏度高、专属性好、简便快捷、准确度高,在单一运行中即可鉴定多种微量的目标化合物,是研究中药材中微量有效成分切实可行的方法。