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杂种优势的利用可以有效地使烟草实现高产、高抗、优质的育种目标。目前,培育雄性不育系是获取杂种烟草最有效的途径。本文以烟草雄性不育相关基因orf25和atp9为对象,通过RNA干扰技术,分别构建了烟草orf25、atp9基因的RNAi表达载体pCAMBIA1301-orf25-RNAi和pCAMBIA1301-atp9-RNAi,并通过农杆菌介导烟草遗传转化技术获得转基因烟草苗,以探讨烟草雄性不育相关基因orf25、atp9的功能及其在烟草雄性不育形成中的作用,为选育烟草雄性不育系植株奠定基础。主要研究结果如下:1、烟草orf25、atp9基因干扰片段的获得:依据实验室保存的orf25、atp9基因全长cDNA序列,分别设计特异性引物,扩增orf25、atp9基因的正、反义干扰片段:orf25基因扩增片段为606bp,atp9基因扩增片段为239bp。2、烟草orf25、atp9基因的RNAi表达载体的构建:根据RNAi表达载体构建原则,将长度为606bp的orf25基因的正、反向干扰片段插入到大小为190bp的linker片段的两侧,长度为239bp的atp9基因的正、反向干扰片段插入到linker片段的两侧,分别构成含linker间隔片段稳定发夹结构的RNA干扰片段。以pET30a和pCAMBIA1301为桥梁载体,成功的构建orf25、atp9基因的RNA干扰表达载体pCAMBIA1301-orf25-RNAi和pCAMBIA1301-atp9-RNAi。3、烟草遗传转化条件的建立:农杆菌GV3101侵染烟草叶片最适宜的侵染浓度OD600值为0.5;最适宜的侵染时间为8分钟;烟草预培养最佳时间为3天;侵染后28℃暗培养最佳时间为3天;抗性筛选物卡那霉素最佳浓度为80 mg/L;农杆菌抑制剂头孢霉素的最佳浓度为400 mg/L。4、烟草转基因苗的获得:利用农杆菌介导法将pCAMBIA1301-orf25-RNAi和pCAMBIA1301-atp9-RNAi分别转入烟草保持系中烟90中,经抗性筛选以及分子检测最终获得35株转pCAMBIA1301-orf25-RNAi烟草植株,其中阳性烟草有18株,转化率为51.4%;获得41株转pCAMBIA1301-atp9-RNAi烟草植株,其中阳性烟草有20株,转化率为48.8%。