异戊二烯是最简单的萜类物质,被广泛应用于合成橡胶、医药和香料等。目前,异戊二烯主要来源于石油基C5馏分。石油资源紧缺和环境污染仍然是石油化工行业面临的巨大难题。随着合成生物学和代谢工程的快速发展,利用微生物细胞工厂生产异戊二烯已成为可能。本文以真核模式微生物酿酒酵母为平台,结合代谢调控和酶定向进化,对酿酒酵母生物合成异戊二烯进行了研究。为了在酿酒酵母中构建异戊二烯生物合成途径,用GAL1启动子异源表达来自于银白杨的异戊二烯合成酶基因(IspS),转入本课题组前期通过增强前体物供应并削弱竞争途径构建的酿酒酵母工程菌YXM08中。在此菌株中,异戊二烯的合成需要半乳糖的诱导。为了消除IspS表达对半乳糖诱导的依赖,在后续工作中敲除了GAL80基因,成功构建了葡萄糖控制型异戊二烯合成途径,得到重组菌株YXM13-ISPS。酿酒酵母中异戊二烯生物合成途径可以分成两个模块:上游MVA途径和下游异戊二烯形成途径。在YXM13-ISPS中,上游MVA途径得到强化,而下游异戊二烯形成途径相对较弱,因此容易造成前体物质DMAPP的过度积累,从而导致菌株生长受到抑制并且异戊二烯产量不高。为了强化下游异戊二烯形成途径从而实现上下游模块间的代谢流平衡,本研究主要围绕异戊二烯合成酶(ISPS)的表达水平和催化活性两方面开展工作。首先,为了增强ISPS的表达,通过过表达GAL4增加激活蛋白Gal4p的供应量,并通过敲除内源GAL1/7/10启动子减少对Gal4p的竞争,使IspS的转录水平提高了6倍,摇瓶培养中异戊二烯的产量从6.0 mg/L提高到23.6 mg/L,而旁路代谢产物角鲨烯的产量从4.1 mg/L下降到2.8 mg/L。同时,由于过度积累的DMAPP被高效地转化为异戊二烯,使菌株的生物量提高了14%。其次,为了提高ISPS的催化活性,建立了基于前体物质DMAPP细胞毒性的高通量筛选方法,并通过引入角鲨烯代谢途径解除DMAPP毒性来验证其有效性。通过突变库筛选和组合突变实现ISPS的定向进化,获得最优突变体ISPSM4。最后结合代谢调控和酶改造,将ISPSM4转入到过表达Gal4p的工程菌中,使异戊二烯的产量从23.6mg/L继续提高到50.2mg/L,细胞干重进一步提高7.1%,而角鲨烯的产量则下降到2.2 mg/L。为了进一步验证强化异戊二烯形成途径策略的有效性,对工程菌YXM13-ISPS、YXM29-ISPS和YXM29-ISPSM4进行有氧批次发酵。与摇瓶发酵结果一致,YXM29-ISPSM4生长最快,异戊二烯产量最高(640 mg/L)。为了实现异戊二烯的高产,以YXM29-ISPSM4为生产菌,进行了补料分批发酵。经过96小时发酵,最终发酵液OD600达到168,异戊二烯产量达到3.7 g/L(得率为22.9 mg异戊二烯/g葡萄糖)。这是目前对真核生物进行代谢改造所获得的最高异戊二烯产量。本研究结合代谢调控和酶定向进化,对异戊二烯形成途径进行了强化,从而实现了上下游途径模块的平衡调控,最终大幅提高了异戊二烯的生物合成效率,为异戊二烯生物合成的工业化生产提供了有力的技术支持。