菊糖(inulin)是植物的第二大储存多糖，在自然界的含量仅次于淀粉，主要存在于菊芋、菊苣等菊科植物中。菊芋因其土壤适应性强，可在干旱、盐碱等非耕边际土地上种植，并且可以海水灌溉，被评价为新型能源植物。以菊芋或菊芋工业废渣为原料生产乙醇，是发展燃料乙醇的重要方向。将菊糖酶产生、菊糖水解和乙醇发酵整合为一体的整合生物加工工艺(CBP)是最经济的菊芋乙醇生产路线。然而，目前尚未研发出菊芋乙醇CBP发酵菌种。酿酒酵母（Saccharymyces cerevisiae）是公认的乙醇生产优势菌种，但是自然酿酒酵母菌株不能水解菊糖。本论文从酵母菌资源筛选出发，试图发掘具有高比活力的新型菊糖酶，并解析菊糖酶的编码基因，进而借助基因工程手段，构建酿酒酵母CBP菊芋乙醇发酵工程菌。　　 以菊糖为唯一碳源筛选菊糖代谢酵母菌37株，其中菌株KRF1具有最高的菊糖水解效率。经分类学鉴定，KRF1是酵母菌新种，命名为Candida kutaonensissp.nov.KRF1T。应用离子交换柱层析以及分子筛层析等方法，纯化了KRF1T菌株的菊糖酶，纯化后酶的比活力是粗酶液的20倍，达到188.27 U/mg蛋白。SDS-PAGE分析表明，酶的分子量约为55.0 kDa。酶学性质分析表明，酶的最适pH和最适温度分别是4.5和50℃;Fe2+和Fe3+对酶有激活作用，Hg2+、Mn2+、Ag+和SDS对酶有抑制作用;酶对底物菊糖的Km和Vmax分别为2.3 mg/mL与4.8mg/min。TLC和HPLC分析表明该酶具有外切菊糖酶活性。　　 应用RACE-PCR方法克隆了KRF1T菌株的菊糖酶基因。该酶基因由1536个碱基组成，其编码的蛋白序列与已知Meyerozyma guilliermondii M30菌株的菊糖酶基因具有最高序列同源性(58％)。将KRF1T菌株的菊糖酶基因在Escherichiacoli BL21(DE3)中进行重组表达，表达产物经质谱鉴定，结果显示外源表达蛋白与从KRF1T发酵液纯化的菊糖酶具有相同的氨基酸序列，证实了克隆基因是KRF1T菌株的菊糖酶基因。　　 本实验室的前期研究发现了一株具有较高菊糖代谢能力的酿酒酵母菌株JZ1C，在该菌株中表达外源菊糖酶基因有望获得CBP菊芋乙醇发酵菌种。在JZ1C和对照菌株BY4741（实验室常用标准菌株）中分别表达了KRF1T菌株的菊糖酶基因和K.marxianus PT-1的菊糖酶基因。结果显示在200 g/L菊糖浓度下，导入KRF1T菊糖酶基因的JZ1C转化子和导入PT-1菊糖酶基因的JZ1C转化子最大乙醇浓度分别为65.9 g/L和59.4 g/L，比对照菌分别提高了15％和3％。导入KRF1T菊糖酶基因的BY4741转化子和导入PT-1菊糖酶基因的BY4741转化子最大乙醇浓度分别为43.2 g/L和33.8 g/L，分别比对照菌提高了80％和41％。　　 菌株KRF1T和K.marxianus PT-1的菊糖酶都为外切菊糖酶，推测此类菊糖酶降解低聚合度菊糖的效率要高于降解高聚合度菊糖。如果在酿酒酵母中导入内切菊糖酶基因，借助内切酶的作用将高聚合度菊糖切割为低聚合度的寡糖，有望提高酿酒酵母工程菌的菊糖发酵效率。基于这一思路，本论文构建了含有Aspergillus niger内切菊粉酶基因的重组表达载体，此载体还含有3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的组成型启动子TDH3p，α信号肽和酵母菌同源序列Ty1。利用该载体将内切菊糖酶基因成功的整合到了JZ1C的基因组中，并且获得了纯合体重组菌株。　　 本论文发现了一个新菊糖酶、克隆了其基因，评价了该基因的实用性，并且构建了酿酒酵母内切菊糖酶表达载体，为研发CBP菊芋乙醇发酵菌种奠定了基础。