IGF是国内外目前的研究热点，而鼻咽癌是具有中国特色的恶性肿瘤。目前尚未有IGFBP-6与鼻咽癌相关研究的报道，我们希望对IGFBP-6与鼻咽癌关系进行深入的研究。本研究将分为三个部分进行研究，第一部分是IGFBP-6表达与晚期鼻咽癌预后的关系；第二部分是IGFBP-6对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和转移的影响；第三部分是IGFBP-6对破骨细胞的形成及鼻咽癌骨质破坏的影响。　　 第一章 IGFBP-6表达与晚期鼻咽癌预后的关系　　 目的：　　 检测鼻咽癌患者病理组织中IGFBP-6的表达，并对IGFBP-6的表达与鼻咽癌临床特征与预后的关系进行探讨。　　 方法：　　 本组76例为1998年9月至2002年12月在我院行鼻咽活检的鼻咽癌标本。采用单克隆IGFBP-6抗体对76例鼻咽癌组织中的IGFBP-6表达进行免疫组化检测。按IGFBP-6的表达水平不同将患者分为两组，分析IGFBP-6表达与临床预后的关系。采用SPSS13.0统计软件包进行数据处理。采用Kaplan-Meier法计算生存率，两因素间生存差异检验采用Log-rank检验。采用Cox比例风险模型进行顸后的多因素分析。　　 结论：　　 鼻咽癌组织中IGFBP-6有不同程度的表达，IGFBP-6的表达是鼻咽癌患者的局部区域复发及远处转移风险有关的因素，其阳性表达提示患者局部区域复发及远处转移风险降低。　　 第二章IGFBP-6对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和转移的影响　　 目的：　　 检测鼻咽癌细胞珠IGFBP-6 mRNA的表达，ELISA检测IGFBP-6的自分泌：体外实验观察IGFBP-6对鼻咽癌细胞珠增殖和侵袭的影响；建立稳定转染CNE2-IGFBP-6shRNA细胞，体内实验探讨IGFBP-6基因干扰后对鼻咽癌细胞转移能力的影响；探讨IGFBP-6的可能作用机制。　　 方法：　　 RT-PCR定性检测鼻咽癌细胞珠IGFBP-6 mRNA的表达；荧光定量RT-PCR检测IGFBP-6 mRNA的定量表达；ELISA检测鼻咽癌细胞珠IGFBP-6的自分泌。MTS检测IGFBP-6对鼻咽癌细胞珠CNE2和HK-1的生长增殖的影响；Boyden侵袭小室检测IGFBP-6对CNE2的侵袭能力的影响。采用阳离子脂质体法稳定转染及筛选表达IGFBP-6 shRNA载体的CNE2细胞。转染后48小时，根据荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在细胞内的表达情况来判断转染效果。荧光定量RT-PCR分析稳定转染CNE2-IGFBP-6 shRNA细胞中IGFBP-6在mRNA水平的表达；Western Blotting检测干扰后IGFBP-6在蛋白质水平上的表达。　　 实验动物分三组，每组5只免疫缺陷小鼠。分别在小鼠心脏注射CNE2、稳定转染CNE2-IGFBP-6shRNA以及HK-1三种肿瘤细胞。每只小鼠注射50μl，约5×105个细胞。密切观察小鼠的生长状态，4周后将小鼠处死，处死前全身骨X片照射。解剖小鼠，暴露内脏各器官，观察肿瘤的生长与转移情况，照相，并进行病理取材。病理取材标本处理后，石蜡包埋组织块，病理切片，HE染色，光学显微镜观察。　　 Western Blotting检测靶基因的干扰效果，探讨IGFBP-6的可能作用机制。　　 结论：　　 鼻咽癌细胞珠CNE2和HK-1均高表达IGFBP-6 mRNA。体外实验证明IGFBP-6能够抑制CNE2增殖和侵袭的能力，体内动物实验显示IGFBP-6基因干扰后能够在一定程度上促进鼻咽癌细胞CNE2的远处器官转移。IGFBP-6的作用机制可能与AKT的磷酸化、抑癌因子PTEN以及IGF-Ⅰ受体有关。　　 第三章 IGFBP-6对破骨细胞的形成及鼻咽癌骨质破坏的影响　　 目的：　　 体外实验检测IGFBP-6对破骨细胞形成的影响；体内实验探讨IGFBP-6基因干扰后对鼻咽癌细胞的骨质破坏能力的影响。　　 方法：　　 培养破骨细胞前体Raw细胞，加入RANKL50ng/ml及M-CSF10ng/ml的DMEM培养液促进破骨细胞的成熟，并同时加予不同浓度的IGFBP-6，诱导6天后，形成成熟破骨细胞，行破骨细胞TRAP染色。小鼠骨髓细胞分离，用含有RANKL50ng/ml及M-CSF10ng/ml的α培养液促进破骨细胞的成熟，同时加予不同的处理，分别为IGFBP-6、CNE2-CM(Conditiong Medium)、CNE2-CM+IGFBP-6-Ab(antibody)，诱导6天后，形成成熟破骨细胞，行破骨细胞TRAP染色。　　 实验动物分三组，每组5只免疫缺陷小鼠。分别在小鼠右侧胫骨骨髓腔注射CNE2、稳定转染CNE2-IGFBP-6 shRNA以及HK-1三种肿瘤细胞。细胞的浓度调整为1×107cell/ml。每只小鼠注射50μl，约5×105个细胞。小鼠肿瘤细胞注射后，继续饲养并密切观察小鼠的生长状态，4周后将小鼠处死，处死前全身骨X片照射。解剖小鼠，暴露内脏各器官，观察肿瘤的生长与转移情况，照相，并进行病理取材。病理取材标本直接置10％福尔马林溶液固定，经处理后，石蜡包埋组织块，病理切片，HE染色，光学显微镜观察，病理玻片TRAP染色。　　 结论：　　 体外细胞实验显示IGFBP-6能够诱导破骨细胞的形成，体内动物实验显示IGFBP-6基因干扰后能够在一定程度上抑制鼻咽癌细胞珠CNE2引起的骨质破坏及破骨细胞形成的能力。　　 全文结论：　　 1.鼻咽癌组织中IGFBP-6有不同程度的表达，IGFBP-6的表达是鼻咽癌患者局部区域复发及远处转移风险有关的因素，其阳性表达提示患者局部区域复发及远处转移风险降低。　　 2.鼻咽癌细胞珠CNE2和HK-1均高表达IGFBP-6 mRNA。体外实验证明IGFBP-6能够抑制鼻咽癌细胞珠CNE2的增殖和侵袭，体内实验显示IGFBP-6基因干扰后能够促进鼻咽癌细胞CNE2的远处器官转移。　　 3.IGFBP-6能够诱导破骨细胞的形成，IGFBP-6基因干扰后能够抑制鼻咽癌细胞珠CNE2引起的骨质破坏及破骨细胞形成的能力。