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目的:通过喂饲高脂食料成大鼠胰岛素抵挡模型,察观亮氨酸和限食对大鼠模型胰岛素锐感能力、脂代谢和肝脏线粒体新生关键基因水平的影响,探讨亮氨酸和限食对胰岛素抵挡和肝脏线粒体新生的作用及其分子机制,为2型糖尿病的预防和治疗贡献新的依据。方法:雄性成年SD大鼠60只,体质量范围170~220 g,按体质量任意分5组(每组12只),分别为基础饲料组(Normal diet,ND)、高脂组(High fat diet,HFD)、高脂饲料+限食组(High fat diet+Calorie restriction,HFD+CR)高脂+1.5%亮氨酸组(High fat diet+Leucine,HFD+Leu),高脂+1.5%亮氨酸+限食组(HFD+Leu+CR),喂养24周。实验结尾,禁食过夜,进行葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验。牺牲动物,取血液和肝脏组织等。测定空腹血糖、血胰岛素,血清低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)和总胆固醇(Total cholesterol,TC),测定肝脏TC、TG。Real-time PCR测定大鼠肝脏过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor coactivator 1α,PGC-1α)、去乙酰化蛋白1(Sirtuin 1,SIRT1)、核呼吸因子1(Nuclear respiratory factor 1,NRF-1)、线粒体转录因子A(Mitochondrial transcription factor A,TFAM)mRNA水平以及线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mt DNA)含量。对肝脏做HE染色,油红O染色以及电镜观察。结果:1.进食量、能量摄入、体质量和脏体比(1)hfd组在2-16周进食量低于nd组(p<0.05);hfd+leu组在1-4周,17-24周进食量低于hfd组(p<0.05);hfd+leu+cr组自第3周进食量低于hfd+cr组(p<0.05)。(2)hfd+cr组和hfd+leu+cr组的能量摄入分别为相应对照组的80%。hfd组能量摄入第1周起高于nd组,并在1-4周高于hfd+leu组(p<0.05);hfd+leu+cr组能量摄入第2周开始低于hfd+cr组(p<0.05)。(3)hfd组体重从第5周起高于nd组(p<0.05);hfd+cr组体重从第3周开始低于hfd组(p<0.05);hfd+leu组体重从第13周开始小于hfd组(p<0.05);hfd+leu+cr组体重从第3周开始小于hfd+leu组,从第15周开始低于hfd+cr组(p<0.05)。(4)hfd组脂肪系数高于nd组(p<0.05)。hfd+cr组肾脏、肝脏、睾丸、脂肪系数少于hfd组(p<0.05)。hfd+leu+cr组脂肪系数少于hfd+cr组,肾脏、睾丸、脂肪系数少于hfd+leu组(p<0.05)。2.胰岛素敏感性(1)hfd组胰岛素水平高于nd组(p<0.05),hfd+cr组和hfd+leu+cr组胰岛素水平分别低于hfd组和hfd+leu组(p<0.05)。各组间空肚血糖无显著性差异(p>0.05)。(2)葡萄糖耐量试验(glucosetolerancetest,gtt)表明,hfd组血糖值和auc高于nd组(p<0.05),葡糖耐量不正常;hfd+cr组、hfd+leu组糖值和auc低于hfd组(p<0.05),hfd+leu+cr组血糖低于hfd+leu组,且auc降低(p<0.05)。(3)胰岛素耐量试验(insulintolerancetest,itt)表明,hfd组血糖值和auc高于nd组(p<0.05),胰岛素耐量不正常;hfd+leu和hfd+cr组血糖值和auc低于hfd组(p<0.05),而hfd+leu+cr组血糖值低于hfd+leu组(p<0.05)。3.肝脏病理(1)肝脏he染色:nd组肝细胞形态正常,几乎没有脂滴;hfd组肝细胞内现圆形单个大的脂滴并将细胞核挤向细胞边界,出现大泡性脂变,并伴有大小较均一的微小脂滴;与hfd组相比,hfd+cr组、hfd+leu组和hfd+leu+cr组对肝细胞形态的损伤变小,脂肪空泡变少。(2)肝脏油红o染色:nd组几乎没有脂肪沉积;hfd组出现大量脂滴;hfd+cr组,hfd+leu组,hfd+leu+cr组肝细胞内脂滴明显减少。(3)通过电镜观察各组大鼠肝脏组织发现,nd组大鼠肝细胞浆中有大量线粒体,几乎没有脂滴,线粒体结构完好,粗面内质网正常;hfd组大鼠肝细胞浆中有大量脂滴出现,线粒体变小,膜和嵴融合,结构受损,粗面内质网增多;与hfd组相比,hfd+cr组、hfd+leu组和hfd+leu+cr组大鼠肝细胞浆中脂滴明显减少,线粒体数量增多,线粒体构型改善,可见清晰的线粒体膜和嵴,粗面内质网扩张程度变弱。4.脂代谢(1)亮氨酸和限食对高脂大鼠血tc、tg、ldl-c、hdl-c的影响hfd组tc、tg水平高于nd组(p<0.05);hfd+cr组tc、ldl、tg水平低于hfd组(p<0.05);hfd+leu组tg水平低于hfd组(p<0.05);hfd+leu+cr组tc、ldl、tg水平低于hfd组(p<0.05),tc水平低于hfd+leu组(p<0.05),ldl水平低于hfd+cr组(p<0.05)。(2)亮氨酸和限食对高脂喂养大鼠肝脏tc、tg的影响hfd组肝脏tc高于nd组(p<0.05);hfd+cr组、hfd+leu组、hfd+leu+cr组肝脏tg低于hfd组(p<0.05)。5.肝脏线粒体生成相关基因(1)hfd组肝脏线粒体生成相关基因nrf-1,pgc-1α,sirt1,tfam的mrna水平表达与nd组相比均有减少趋势,tfam有显著性差异(p<0.05);hfd+cr组和hfd+leu组nrf-1,tfam表达高于hfd组(p<0.05);hfd+leu+cr组nrf-1,pgc-1α,tfam表达高于hfd组(p<0.05)。(2)hfd组肝脏mtdna水准少于nd组,但差异没有显著性(p>0.05);hfd+leu+cr组大鼠肝脏mtdna表达高于hfd组(p<0.05)。结论:亮氨酸和限食可以降低高脂大鼠的胰岛素抵挡,改善脂代谢紊乱;亮氨酸和限食可以改善肝脏线粒体生成相关基因nrf-1,pgc-1α,sirt1,tfam的表达,提高肝脏线粒体生成,改善胰岛素抵抗。本成果对寻求新的膳食策略对抗胰岛素抵制和2型糖尿病意义非常。