论文部分内容阅读
研究背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率高、起病隐匿、复发率高、较常耐药,目前治疗上仍采取手术治疗为主,但预后仍差强人意,因此寻找新的具有诊断及预后价值的分子靶标是十分必要的。微小RNA（miRNA）是非编码RNA中的一种类型,以RNA形式在转录水平、转录后修饰等方面调控基因的表达。既往研究显示miR-196b-5p在多种恶性肿瘤里异常表达并影响着肿瘤细胞的各种生物学行为,然而miR-196b-5p在肝细胞癌中的临床意义及发挥作用的具体机制未见报道。内皮素受体B（endothelin receptor type B,EDNRB）是G蛋白偶联受体家族成员之一。研究表明,EDNRB在多种恶性肿瘤异常表达,同时参与了恶性肿瘤的发生发展进程。已有研究提出EDNRB肝细胞癌里低表达,同时可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力。然而,miR-196b-5p与EDNRB的关系未见国内外文献报道,两者在肝细胞癌进展中的分子机制也仍待进一步阐明。研究目的:探索miR-196b-5p与EDNRB在肝细胞癌患者中的临床意义及可能机制。研究方法:1.通过对TCGA数据库里的miRNA的表达及临床病理参数进行分析,同时对GEO数据库里的miRNA芯片进行分析,探索miR-196b-5p在肝细胞癌里的表达水平及临床意义。2.实时荧光定量PCR检测67例肝细胞癌患者癌和相对应癌旁石蜡包埋组织miR-196b-5p的相对表达量,比较其与临床病理参数的关系。3.联合TCGA、GEO及实时荧光定量PCR的miR-196b-5p表达量结果行Meta分析。4.通过12个在线软件预测miR-196b-5p的靶基因,挑选出至少在5个软件均能预测得到的基因与TCGA表达下调的mRNA取交集,筛选出miR-196b-5p的潜力靶基因。对潜力靶基因进行GO和DO功能注释、KEGG通路富集分析、PPI网络构建、Spearman秩相关分析及结合位点预测,而后结合文献选定miR-196b-5p的靶基因进行进一步的深入研究。5.通过TCGA和GEO数据库分析EDNRB的表达谱数据,探索EDNRB在肝细胞癌里的表达水平及临床意义。6.通过免疫组织化学技术检测上述67例肝细胞癌患者癌和相对应癌旁石蜡包埋组织EDNRB的蛋白表达量,比较其与临床病理参数的关系。7.双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-196b-5p与EDNRB是否有直接结合的靶向关系。研究结果:1.对TCGA测序数据与GEO芯片数据分析发现miR-196b-5p的表达水平在肝细胞癌组织里显著高于正常对照肝组织(SMD=0.54,95%CI:0.35-0.73,P heterogeneity=0.206,I2=26.7%),同时其表达水平与肝细胞癌患者性别（P=0.035）、病理分级（P=0.041）、脉管浸润（P=0.023）有密切关系。2.实时荧光定量PCR证实了miR-196b-5p的表达水平在肝细胞癌组织里显著高于相对应的癌旁肝组织（P=0.0007）。miR-196b-5p表达水平与肝细胞癌患者的肿瘤大小（P=0.03）、结节数量（P=0.024）、脉管浸润（P=0.029）及包膜浸润（P=0.026）相关。3.联合TCGA、GEO及实时荧光定量PCR的miR-196b-5p表达量结果行Meta分析,结果证实miR-196b-5p的表达水平在肝细胞癌组织里显著高于正常对照肝组织(SMD=0.56,95%CI:0.39-0.72,P heterogeneity=0.275,I2=18.3%)。4.通过12个在线软件预测miR-196b-5p的靶基因,挑选出至少在5个软件均能预测得到的基因与TCGA表达下调的mRNA取交集,最终得到107个miR-196b-5p的潜力靶基因。对107个潜力靶基因进行GO和DO功能注释、KEGG通路富集分析以及PPI网络构建,重点研究KEGG癌症通路里的9个基因。从TCGA数据库下载相应数据对KEGG通路里的9个基因行Spearman秩相关分析,结果显示miR-196b-5p与EDNRB、雄激素受体（androgen receptor,AR）、叉头框O1基因（forkhead box O1,FOXO1）及胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor 1,IGF1）存在负相关关系,同时软件预测到miR-196b-5p与EDNRB、FOXO1存在碱基互补配对的情况,结合文献筛选定EDNRB进行下一步研究。5.分析TCGA和GEO数据库中EDNRB的表达谱发现EDNRB的表达水平在肝细胞癌组织里低于正常对照肝组织(SMD=-1.48,95%CI:-1.63-（-1.33）,P heterogeneity=0.116,I2=32.4%)。6.免疫组织化学技术证实EDNRB蛋白在肝细胞癌组织里的表达低于相对应的癌旁组织（P<0.0001）。分析EDNRB表达水平与临床病理参数的关系,结果显示EDNRB的表达水平与肝细胞癌患者血检AFP的量（P=0.055）有相关的趋势,需进一步扩大样本量证实。7.双荧光素酶报告基因检测结果发现miR-196b-5p与EDNRB未存在直接结合的靶向关系。研究结论:1.miR-196b-5p在肝细胞癌组织里的表达水平显著高于正常对照肝组织,其表达量与脉管浸润等肝细胞癌侵袭转移相关的临床病理参数有密切关系。2.EDNRB在肝细胞癌组织里的表达水平显著低于正常对照肝组织。3.miR-196b-5p与EDNRB对肝细胞癌的侵袭转移可能发挥了重要作用,但两者没有直接结合的靶向关系,其发挥作用的具体机制仍需进一步研究。