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背景急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是由多种病因和机制引起的以肾功能迅速下降为特征的临床综合征。其中脓毒血症是临床中最常见的急性肾损伤病因之一。约有47.9%的病人诊断为脓毒血症伴有急性肾损伤,且患病率呈增加态势,并且脓毒血症伴有急性肾损伤（septic acute kidney injury,SA-AKI）患者其病死率超过单纯患有脓毒血症的患者。目前临床诊断SA-AKI的生物学指标中仍主要依据血肌酐和尿量,这些指标出现时间较晚且结果易受饮食、感染和主观等因素的影响。新型生物学指标如肾损伤因子-1（kidney injury molecule-1,Kim-1）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin,NGAL）等用于诊断AKI特异度较低,目前还没有简单、有效且无创的方法用于诊断SA-AKI。小RNA（micro RNA,miRNA）是一种长度为19-25个核苷酸的非编码RNA,参与多个基因的转录后调控。miRNA同样在包括急性肾损伤疾病在内的多种肾脏疾病的发生发展中起重要作用。我们的研究发现尿沉渣脱落细胞中可检测出多种miRNA信息,某些miRNA有望成为诊断脓毒血症急性肾损伤的无创生物标志物。目的本研究拟利用miRNA高通量测序技术,对SA-AKI患者、脓毒血症未发生AKI患者、健康志愿者尿沉渣及SA-AKI细胞模型进行检测。结合生物信息学技术,筛选出脓毒血症相关急性肾损伤特异性miRNA。继而通过扩大验证样本量进行实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-q PCR）验证并筛选出SA-AKI特异性的miRNA生物标志物。评估这些miRNA在SA-AKI诊断中的作用,为SA-AKI无创诊断生物标志物的发现奠定研究基础。方法1脓毒血症急性肾损伤尿沉渣miRNA表达谱测定1.1收集2020年10月-2021年1月在河南省人民医院ICU住院患者尿标本。实验组为SA-AKI患者的尿沉渣标本,健康对照组（Healthy Control,HC）为同时期同医院进行体检的健康人尿沉渣标本,疾病对照组为脓毒血症未发生AKI的患者。留取患者入院后发生脓毒血症24h内清晨尿液标本及脓毒血症患者发生AKI 24h内清晨尿液标本,健康对照组留取清晨尿标本,收取后在低温离心机进行离心,最终获得尿沉渣标本,将其保存于-80℃冰箱内。1.2miRNA高通量测序分析技术由联川生物公司提供服务,其实验的标准步骤按照Illumina公司提供的实验流程进行,包括文库的制备和测序实验。选取4例SA-AKI患者、4例脓毒血症患者、4例HC患者尿沉渣进行miRNA表达谱的测定。对各组间表达水平有差异且有统计学意义的miRNA进行数据的综合分析,同时利用GO（Gene Ontology,GO）数据库及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）等数据库和生物信息分析技术进一步筛选。2 LPS诱导HK-2细胞的SA-AKI细胞模型miRNA表达谱测定及共同差异miRNA的筛选2.1 LPS刺激HK-2细胞建立SA-AKI细胞模型的建立。细胞实验大体上分为:空白对照组（NC组）及LPS（10ug/m L）处理2h、6h、12h、24h组。RT-q PCR检测各组细胞标本中炎症因子IL-1β、IL-6 m RNA的表达变化。2.2本实验采用LPS（10ug/ml）刺激HK-2细胞建立SA-AKI细胞模型。LPS处理为实验组（LPS组）、未做处理为空白对照组（NC组）,每组样本量n=4,细胞培养24h后,离心收取细胞,按每10~6个细胞加入1ml TRIzol后进行RNA的提取。RNA质检合格后使用联川生物公司miRNA高通量测序技术,对各组表达水平有差异且有统计学意义的miRNA进行数据的综合分析,同时利用GO数据库及KEGG等数据库和生物信息分析技术进一步筛选。2.3通过比对方法1.2及方法2.2测序结果筛选出SA-AKI患者尿沉渣与LPS刺激HK-2细胞的共同差异miRNA。3 miR-330-3p的表达验证及其对SA-AKI早期诊断意义。3.1运用RT-q PCR技术,扩大病人尿标本的验证样本量,在脓毒血症患者和SA-AKI患者中对miR-330-3p进行表达水平检验。3.2运用RT-q PCR技术,在LPS（10ug/ml）刺激HK-2细胞0h和分别刺激2h、6h、12h、24h时对miR-330-3p进行表达水平检验。3.3分析miR-330-3p与临床指标的相关性;评估miR-330-3p用于SA-AKI的诊断价值;3.4绘制受试者作业特征（Receiver Operating Characteristic,ROC）曲线,计算miR-330-3p在诊断SA-AKI的敏感度和特异度。结果1本实验中我们构建了SA-AKI患者,脓毒血症患者和健康对照尿沉渣miRNA表达图谱。1.1脓毒血症组与HC组相比,共有71个miRNA表达水平差异有统计学意义（P<0.05）;SA-AKI与HC组相比,共有76个miRNA表达水平差异有统计学意义（P<0.05）;脓毒血症组与SA-AKI组相比,共有43个miRNA表达水平差异有统计学意义（P<0.05）。1.2通过对SA-AKI组、脓毒血症组、HC组各组间差异miRNA的比较发现有18个miRNA在SA-AKI组与脓毒血症组、SA-AKI组与HC组对比中有表达,在脓毒血症组与HC组对比中无表达。2本实验中我们构建了LPS刺激HK-2细胞24h组和NC组miRNA表达图谱。2.1 LPS刺激HK-2细胞24h时炎症因子表达较高。选取LPS（24h）组作为SA-AKI细胞模型实验组。2.2 LPS（24h）组与NC组相比,共有4个miRNA表达水平差异有统计学意义（P<0.05）。其中LPS（24h）组较NC组表达水平升高的miRNA有2个,降低的有2个。两组间差异有统计学意义（P<0.05）。2.3通过对结果1.2及结果2.2进行筛选后发现miR-330-3p为两者共同差异表达的miRNA。本研究认为miR-330-3p为SA-AKI尿沉渣中肾小管上皮细胞来源的特异性miRNA。3本实验对miR-330-3p表达验证及其对SA-AKI早期诊断意义进行探讨。3.1脓毒血症患者与SA-AKI患者尿沉渣中的miR-330-3p的表达水平存在统计学差异（P=0.0058）。miRNA表达水平用2-△△CT表示,SA-AKI组miR-330-3p的表达量4.641（0.733,12.90）高于脓毒血症组0.689（0.482,0.997）。3.2在LPS（10ug/ml）刺激HK-2细胞0h和分别刺激2h、6h、12h、24h时miR-330-3p的相对表达量均高于0h组（P<0.05）。3.3 miR-330-3p与临床指标相关性分析发现,miR-330-3p与白细胞、C反应蛋白、血红蛋白、血小板、血清肌酐、血清尿素、SOFA评分都有相关性,但相关性不明显。3.4将验证队列验证所得SA-AKI组与脓毒血症组差异表达的miR-330-3p绘制ROC曲线,AUC（area under the curve,AUC）表示曲线下面积。miR-330-3p曲线下面积为0.737,最佳截断值为0.604时,灵敏度为0.654,特异度为0.995,95%CI值0.573-0.899,P值是0.0064。结论miR-330-3p在SA-AKI患者尿沉渣及LPS刺激HK-2细胞的SA-AKI细胞模型中表达水平均升高;miR-330-3p有望成为SA-AKI的新型无创诊断生物标志物。