MicroRNA是一类内源性的长约21-23nt的单链非编码RNA分子,通过与靶基因的互补进行转录后水平的调控。随着越来越多mi RNAs的发现以及相关研究的深入,它们的产生及作用方式也逐渐清晰。miRNAs不但参与了昆虫的生长发育过程,并且在昆虫与病原体相互作用等免疫防御方面发挥重要作用。然而,对家蚕miRNAs研究比较晚。现有的研究表明;家蚕在感染蚕核型多角体病毒(BmNPV)后会表达抗病毒的mi RNAs以应对病毒的增殖。miRNAs在宿主-病原体之间相互作用的分子机制中起着重要的作用,不但宿主在受到病毒感染后表达防御性的miRNAs,而且病毒侵入到宿主后也能表达miRNAs来破坏宿主的防御机制,以促进自身的增殖。本文通过对家蚕mi RNAs调控BmNPV基因的研究,从而丰富了家蚕先天免疫分子机制研究的基础信息。主要研究结果如下:一、bmo-miR-217及bmo-miR-390的靶基因预测及表达分析1.利用高通量测序的方法,并经过筛选得到两条由BmNPV引起差异表达的家蚕mi RNAs(bmo-miR-217、bmo-miR-390)。2.利用在线mi RNA靶基因预测软件,以家蚕bmo-miR-217为对象,预测BmNPV中存在的bmo-miR-217的靶基因,结果bmo-miR-217的靶基因有14个。以家蚕bmo-miR-390为对象,共预测到bmo-mi R-390的靶基因10个。3.通过试验验证bmo-mi R-217、bmo-miR-390在实验组(添食病毒家蚕)及对照组中(未添食病毒家蚕)都有表达,并且bmo-miR-217在实验组中的表达量高于对照组。而bmo-miR-390的表达量实验组低于对照组。4.应用qRT-PCR分析了家蚕感染BmNPV不同时期血淋巴中bmo-miR-217及BmNPV-lef-1的相对表达水平。家蚕在感染病毒0h-24h时间段bmo-miR-217表达量逐渐上升,而BmNPV-lef-1基因的表达量逐渐降低;在24h-120h时间段bmo-miR-217与BmNPV-lef-1基因表达趋势大致相似,24h-48h BmNPV-lef-1基因表达量急剧上升但bmo-miR-217上升缓慢,在48h-96h间bmo-miR-217下降趋势没有BmNPV-lef-1基因表达量下降趋势快;在120h-144h时间段BmNPV-lef-1基因表达量骤升,而bmo-miR-217表达量骤降。5.在分析家蚕感染BmNPV不同时间的家蚕血淋巴组织中bmo-miR-390和BmNPV-cg30基因表达量数据显示:家蚕在感染BmNPV的24h内BmNPV-cg30基因的表达平缓而bmo-miR-390表达急剧升高;在24h-48h BmNPV-cg30基因表达骤升,而bmo-miR-390表达开始降低;在48h-96h时间里BmNPV-cg30表达量开始骤降后趋于平缓,而bmo-miR-390表达趋势也在逐渐下降;在96h-144h感染时间段bmo-miR-390和BmNPV-cg30基因表达量都在升高但bmo-miR-390升高趋势要早于BmNPV-cg30基因表达的时间。二、bmo-miR-217及bmo-miR-390功能的初步研究1.克隆获得了bmo-mir-217、bmo-mir-390的基因片段,并构建pcDNA3.0(IE-1-egfp-bmo-mir-217-SV40)、pcDNA3.0(IE-1-egfp-bmo-mir-217-SV40)表达载体;构建pGL3(A3-luc-lef-1 3’UTR-SV40)和pGL3(A3-luc-BmNPV-cg303’UTR-SV40)两个miRNAs的靶基因表达载体。2.利用双荧光素酶活性检测系统研究bmo-miR-217对BmNPV-lef-1的调控作用,结果显示:bmo-miR-217可以下调lef-1的表达。3.通过检测双荧光素酶活性发现bmo-miR-217对BmNPV-lef-1基因表达有抑制作用。后续,我们转染bmo-miR-390质粒及bmo-miR-390 mimic到感染BmNPV的BmN细胞,检测BmNPV-cg30基因的表达,结果显示:cg30基因的表达受到bmo-miR-390的下调作用而导致其表达降低。