家蚕具有强大的泌丝功能,这是目前其作为重要经济昆虫的核心,随着分子生物技术的发展,人们不再满足于蚕丝仅用于丝绸生产,更希望通过新研究技术开拓蚕丝的新用途服务于人类,例如利用丝蛋白再生的方式制备药物传递系统,提高药物利用效率;改进饲喂方法生产可导电的蚕丝;利用遗传手段使家蚕分泌与蜘蛛丝力学性能相媲美的蚕丝;通过蛋白质组学发现蚕丝活性蛋白等等。家蚕之所以受到如此多的关注,得益于其独特的生理和生化特性。家蚕的遗传背景清楚,其丝腺具备强大的丝蛋白合成分泌能力,具备作为生物反应器的潜力。随着家蚕基因组框架图、精细图和遗传变异图的绘制完成,人们对蚕丝的基因合成调控机制有了深入的认识。通过对家蚕丝腺表达系统的不断改进,研究人员已经成功在家蚕丝腺中重组表达出多种具有生物活性的外源蛋白。通过该策略,外源蛋白随着丝蛋白一起分泌,并“镶嵌”在蚕丝中,形成功能性蚕丝纤维,并基于此进一步创制功能性蚕丝蛋白生物材料,用于组织工程修复和作为药物载体。所以,利用家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白,联合蚕丝蛋白制备功能性生物材料,对于提高蚕丝的附加值,扩展家蚕的应用范围,发展家蚕产业具有重要意义,与此同时也为重组蛋白的表达生产提供新的思路,对未来生物工程发展提供新的方向。基于以上思考,本研究重点开展了以下研究工作:1)利用家蚕丝腺表达系统表达具有免疫功效的重组人乳铁蛋白(recombinant human lactoferrin,rhLF),鉴定rhLF表达量,根据最高表达量建立可稳定遗传的转rhLF家蚕品系,调查转rhLF家蚕品系的经济性状;2)从rhLF蚕茧纯化获得rhLF,计算纯化得率,确定纯化工艺,测定rhLF纯度、二级结构和N糖基化修饰;3)体外检测rhLF抗炎和抗菌活性;4)利用家蚕生产的rhLF蚕丝制备rhLF丝胶水凝胶,检测rhLF水凝胶的二级结构、形态结构、rhLF释放特性、rhLF水凝胶稳定等理化性质;5)体内和体外检测rhLF水凝胶的毒性,为后续体内活性评价提供参考;6)体内检测rhLF水凝胶增强小鼠免疫力;7)rhLF水凝胶药代动力学。本研究主要获得以下结果:1、rhLF转基因家蚕品系建立人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF)是一种多功能糖蛋白,属于先天免疫的重要组成部分。LF的应用非常广泛,医药方面可用于预防早产或者治疗老年人慢性炎症;食品方面可添加至婴幼儿配方奶粉作为营养补充剂;美容方面可添加至化妆品等。因此,LF市场需求非常旺盛。我们利用家蚕中部丝腺表达系统进行rhLF表达。首先,从NCBI查阅hLF编码序列,根据家蚕密码子偏好进行优化合成rhLF基因,基于piggyBac构建家蚕中部丝腺表达载体,AscI酶切验证表达载体构建成功。将表达载体显微注射至蚕卵(G0代),饲养孵化的蚕卵至成虫并经过交配产卵形成G1代,对G1代蚕卵、蛹和蛾子荧光筛选共获得12个阳性蛾圈,阳性率为27.9%。提取65个不同阳性个体的蚕茧进行SDS-PAGE检测,结果可见明显的rhLF特异性条带,条带分子量约80 kDa,与rhLF理论分子量大小一致,WB(western blot)免疫印迹分析结果显示该特异性条带可以与rhLF抗体结合。选取rhLF表达量最高的个体建立转基因家蚕品系。利用反向PCR检测rhLF基因插入了家蚕基因组Chr.8,nscaf 2827:8517795-8518010。随后,我们调查了rhLF家蚕品系的经济性状,rhLF和WT蚕茧全茧量、茧层量和茧层率均没有显著性差异。2、rhLF分离纯化、结构特性及活性检测饲养rhLF家蚕品系并获取rhLF蚕茧,提取rhLF丝胶蛋白进行SDS-PAGE和WB检测,以已知浓度rhLF-STD为对照,经计算可知1 g蚕茧含12.07 mg rhLF。为便于纯化,我们在rhLF基因C端加了His标签,因此可以通过镍离子亲和层析柱将蛋白纯化出来,从1 g蚕茧中可获得纯度为95.17%的rhLF 9.24 mg,纯化得率为76.55%。rhLF结构特性与其活性密切相关,因此,我们首先比较了rhLF与rhLF-STD的二级结构。相同蛋白浓度rhLF和rhLF-STD的α螺旋、β折叠、无规则卷曲和β转角含量无显著差异。进一步检测rhLF的N糖基化修饰发现,rhLF共有3个潜在修饰位点,分别为Asn-138,Asn-479和Asn-624,8种糖基化修饰类型是GlcNAc(2)Man(3),GlcNAc(2)Man(5),GlcNAc(2)Man(6),GlcNAc(3)Man(3),GlcNAc(4)Man(3),GlcNAc(4)Man(4),GlcNAc(5)Man(3)和GlcNAc(4)Man(3)Fuc(1)。rhLF的结构检测结果预示其具有活性,从体外抗菌和抗炎两方面进行检测发现,rhLF能够显著抑制革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)的生长,经过rhLF处理的大肠杆菌菌落生长与蛋白处理浓度呈剂量依赖性;此外,rhLF能够显著降低LPS诱导巨噬细胞raw264.7产生NO、TNF-α和iNOs等炎性因子。3、rhLF水凝胶制备及其理化性能分析丝胶分子量超过300 kDa,在8M尿素中呈溶液状态,经过除盐及低温诱导可自组装成水凝胶。利用此方法,我们制备了WT和两种rhLF浓度的丝胶水凝胶,即rhLF-sh-L和rhLF-sh-H丝胶水凝胶。FTIR检测WT和rhLF-sh-L水凝胶二级结构,两种丝胶水凝胶二级结构基本一致,rhLF-sh-L水凝胶β折叠含量高达46.8%,SEM扫描形态结构发现水凝胶呈3D网格状,高β折叠含量和网格状结构说明水凝胶稳定。进一步检测rhLF从水凝胶中释放的特性,用酸性、中性和碱性PBS处理rhLF水凝胶发现,酸性条件最有利于rhLF释放,240 min释放量为31.45%,碱性条件rhLF释放量最低。rhLF水凝胶稳定性对于其长期储存应用非常重要,我们将rhLF水凝胶置于4℃、25℃和37℃避光保存,经过8周之后检测水凝胶种rhLF含量,结果显示4℃条件下水凝胶rhLF含量最高,25℃和37℃条件水凝胶rhLF含量相似,说明低温有助于rhLF水凝胶的保存。4、rhLF丝胶水凝胶毒性检测生物材料的毒性对其应用研究至关重要,我们从体内和体外检测rhLF水凝胶的毒性。用rhLF和WT丝胶水凝胶分别与NIH-3T3细胞共培养24 h,显微镜下观察各组细胞的形态没有发生异常,CCK-8试剂盒检测细胞活力结果显示各组细胞之间无显著性差异。进一步在体内检测丝胶水凝胶毒性过程,我们先饥饿处理小鼠12 h,随后进行大剂量WT和rhLF丝胶水凝胶的灌胃。连续观察小鼠的生长状态14 d,观察期间所有小鼠均存活,小鼠外观和生理活动正常,体重增长趋势正常。观察期结束后取血检测了小鼠的血常规和部分肝功能肾功能指标,各组小鼠血液指标无显著性差异。解剖各组小鼠,取小鼠心、肝、脾、肺和双肾进行脏器指数测定,各组小鼠之间呈无显著性差异,且各脏器外观形态正常。这些结果表明口服丝胶水凝胶不会引起小鼠中毒,初步证明了丝胶水凝胶无毒性。5、rhLF水凝胶增强免疫抑制模型小鼠免疫力化疗是癌症治疗主要手段之一,化疗药物使用的同时常给患者带来严重的副作用,如免疫器官的萎缩、恶心、呕吐、脱发等等。我们用化疗药物(环磷酰胺,CTX)建立免疫抑制小鼠模型,随后每天进行WT-sh、rhLF-sh-L和rhLF-sh-H丝胶水凝胶灌胃,此外以生理盐水(S)作为阴性对照,rhLF-STD作为阳性对照,健康小鼠作为空白对照,实验结束前进行多种与免疫力相关的指标测定。实验结果表明,rhLF-sh-L和rhLF-sh-H有效增加了免疫抑制小鼠血液的白细胞和淋巴细胞数量,对小鼠胸腺和脾脏器官进行了重塑,增强了小鼠脾脏CD3分子的表达。结合碳粒廓清指数、迟发型超敏反应(DTH)和强迫游泳试验(FST),结果表明,口服rhLF丝胶水凝胶有助于清除异物,维持机体内环境稳定,延长小鼠游泳时间。提取小鼠脾脏总mRNA,用荧光定量PCR检测了免疫相关因子mRNA的表达情况,脾脏CD3、IL21、IL2和IL18的mRNA经过rhLF水凝胶处理后显著提高了,与之前取得的结果相符。利用16s rRNA进行各组小鼠肠道微生物的组成检测,虽然各组小鼠之间肠道微生物的种数没有发生变化,但它们的微生物组成有较大差异,S、WT-sh、rhLF-sh-L、rhLF-sh-H和rhLF-STD组与CK组组成差异性分别为2.54%、1.95%、1.09%、1.40%和1.24%,这些结果表明rhLF丝胶水凝胶和rhLF-STD溶液降低了CTX诱导的小鼠肠道菌群变异。6、rhLF体内药代动力学研究我们对小鼠灌胃了rhLF-sh-L和rhLF当量的rhLF-STD溶液,一定时间点后取小鼠血浆检测rhLF含量。比较两组样品处理的小鼠血浆rhLF含量发现,70~150 min时间内,rhLF-sh-L处理组小鼠血浆rhLF浓度显著高于rhLF-STD处理组,经过计算丝胶水凝胶将rhLF生物利用率提高了38%。近红外荧光检测丝胶水凝胶在小鼠肠道停留时间发现,丝胶水凝胶可以在胃肠道停留超过12 h。综上所述,丝胶水凝胶可保护rhLF穿过复杂的消化系统,延长在胃肠道的停留时间,从而有利于rhLF被机体吸收用于提高免疫抑制模型小鼠的免疫力。