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血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化的早期表现,是一种弥散性病变,是人类心血管疾病的主要危险因素之一。因此,本研究探讨了大黄酸、川芎嗪、人参皂甙Re/Rgl对氧胁迫状态下人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cells,HUVEC)的保护作用,旨在筛选干预血管内皮功能障碍的功效成分,从多路径探讨其作用的分子生物学机理,为预防和治疗血管内皮功能障碍提供理论依据。
本研究采用H2O2诱导建立内皮细胞氧化损伤模型。将细胞分为对照组、H2O2损伤组和2～5个药物组。测定各实验组内皮细胞乳酸脱氢酶(lactic aciddehydrogenase,LDH)释放率、超氧化物歧化酶(super oxide dlsmutase,SOD)、一氧化氮合酶(nitrogen oxide synthase,NOS)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)的活性,丙二醛(malondialdehyde,MDA)、NO生成量的变化趋势;通过MTT、激光共聚焦、流式细胞术评估正常和氧化损伤HUVEC的存活率、细胞形态、凋亡、膜电位等指标;利用qRT-PCR和双向电泳分析各实验组的蛋白和基因水平(Caspase3,8,9和eNOS);HPLC测定药物分子在细胞内的吸收和代谢,建立HPLC测定药物分子在细胞内的吸收和代谢的快速测定方法。应用蛋白质组学技术,从整体水平分析所用药物对细胞氧化损伤保护作用的分子机制。其具体结果如下:
1.采用H2O2诱导成功地建立了血管内皮细胞氧化损伤模型,激光共聚焦显微镜观察的结果表明,细胞形态发生了明显改变,产生了凋亡小体,说明H2O2可能是通过促进细胞凋亡而使细胞受到损伤。
2.当大黄酸和川芎嗪浓度分别达到32μmol/L和160μmol/L时,会抑制HUVEC的存活,细胞的形态发生明显改变,呈现细胞毒性;人参皂甙Rgl/Re达到250μmol/L时,未见明显的细胞毒性。
3.应用HPLC测定细胞培养液所含大黄酸、川芎嗪、人参皂甙Re/Rgl的浓度,发现随着孵育时间的延长,上述物质的浓度均有不同程度的下降。说明这些物质能够进入细胞从而行使其保护细胞免受损伤的功能。
4.大黄酸、川芎嗪、人参皂甙Re/Rgl均能逆转或者消减H2O2对血管内皮细胞产生的损伤,能使血管内皮细胞损伤的指标——L,DH释放率降低,细胞的SOD和GSH-Px活性升高,细胞的清除自由基的能力上升,细胞的脂质代谢产物MDA的含量减少。说明上述物质可能是通过抗氧化机制保护了细胞免受氧化损伤;
5.H2O2诱导了NO分泌量、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxidesynthase,eNOS)活性和eNOS mRNA表达水平下降(p＜0.05),而大黄酸、川芎嗪、人参皂甙Re/Rgl能减弱H2O2诱导的eNOS活性和eNOS mRNA表达水平的下降。表明上述物质可提高eNOS活性进而增加NO的分泌量,从而保护细胞免受氧化损伤。这可能是大黄酸、川芎嗪、人参皂甙Re/Rgl保护内皮细胞损伤的另一个作用机制;
6.通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜,测定了细胞膜电位、细胞凋亡数量、实时观察了细胞内Ca2+的变化,发现H2O2能够诱导内皮细胞凋亡。而大黄酸、川芎嗪、人参皂甙Re/Rgl能够减少H2O2诱导的凋亡细胞数,恢复细胞膜电位,降低细胞核和细胞胞浆的Ca2+浓度,显著下调Caspase3,8,9的活性和mRNA的表达,说明他们能够通过与线粒体诱导途径相关的Caspase依赖的抗凋亡机制保护内皮细胞免受氧化损伤。
7.蛋白质组学的研究结果表明,H2O2诱导了7个蛋白点的表达水平发生了上调,这些蛋白可能是通过氧化、促凋亡、影响能量代谢、脂肪代谢和DNA合成等方式导致了细胞损伤。人参皂甙Re可以使5个蛋白表达水平发生了上调,这些蛋白主要是通过抗氧化、降低外周血管阻力等过程来防止细胞的氧化损伤。
综上所述,大黄酸、川芎嗪、人参皂甙Re/Rgl主要是通过抗氧化、抗凋亡、启动NOS-NO系统、降低外周血管阻力等方式保护HUVEC免受氧化损伤。上述四种物质对H2O2诱导的氧化损伤内皮细胞的保护作用及其机制的阐述为动脉粥样硬化等心血管疾病的药物干预和治疗提供了科学依据。