越来越多的基础研究和临床研究证实，心室重构是导致心功能减退和临床不良预后的主要原因。左室重构的病理改变包括两个方面：一是心肌细胞的肥大、坏夕匕和凋亡，二是成纤维细胞(cardiac fibroblast cells，CFs)的增殖和心肌间质纤维化。以往研究的焦点主要集中于心肌细胞结构和功能异常的预防和逆转，但近年来人们逐渐认识到，CFs增殖，分泌MMPs(Matrix Metalproteinases，MMPs，基质金属蛋白酶)在心室重构中起着十分重要的作用，因而成为心力衰竭治疗的一个新靶标[1-4]。 核转录因子AP-1的活化在心脏疾病中的作用已逐渐受到人们的关注。体内外研究表明在许多因素刺激下(如Ang Ⅱ，机械牵拉，神经体液调节等等)可引起AP-1的活化，在成纤维细胞增殖和MMPs合成中起着重要的作用。因此，本研究设想从基因水平特异性地阻断CFs内的AP-1的活性以减轻心肌纤维化和心室重构的进展。Decoy ODNs技术作为一种新的基因治疗策略，可以特异性地阻断核转录因子的活性而抑制下游基因的表达，也极可能成为有效治疗心脏疾病的新方法。为了证实研究的设想，并为AP-1 decoy ODNs治疗心室重构疾病提供理论依据和技术基础，本研究借助阳离子脂质体介导的基因转染技术，首次应用AP-1 decoy ODNs竞争性地封闭CFs中AP-1的转录活性，进行了一下几个方面的研究。 本研究共分3部分论述： 第一章 AP-1及MMPs在人急性心肌梗死心脏组织中的表达目的：观察AP-1、MMP-2、MMP-9及MMP-13在急性心肌梗死患者心脏组织中的表达，探讨AP-1及MMPs在心肌梗死中的作用。 方法：采用免疫组织化学技术分别检测AP-1亚单位c-Jun、MMP-2、MMP-9及MMP-13在人急性心肌梗死后心脏组织及正常心脏组织中的表达。 结果：(1)正常心脏组织可组成型表达c-Jun，主要位于心肌细胞及心肌成纤维细胞中，心肌梗死心脏组织中，c-Jun表达上调，明显高于正常心肌组织。(2)正常心脏组织可见表达MMP-2、MMP-9及MMP-13，主要位于心肌细胞及心肌成纤维细胞中，急性心肌梗死心脏组织中，MMP-2、MMP-9及MMP-13明显表达上调，高于正常心肌组织(3)在急性心肌梗夕匕后心脏组织中，MMP-9和MMP-13表达水平与c-Jun增高明显成正相关。 结论：急性心肌梗死周边区AP-1及MMPs表达均升高，这些研究提示AP-1转录激活及MMPs表达增加在心肌梗死心室重构中发挥重要的作用。 第二章AP-1 decoy ODNs对Ang Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞的增殖及胶原合成的影响第一节新生SD大鼠心肌成纤维细胞的分离、培养和鉴定目的：探讨建立大鼠心肌成纤维细胞分离、培养的方法。 方法：无菌条件下剪取SD大鼠乳鼠心室肌，采用胰酶消化的方法消化心室，差速贴壁法分离心肌成纤维细胞，进行体外培养、扩增，观察所培养细胞的形态，并用免疫细胞化学方法检测纤维连接蛋白、波形蛋白及平滑肌激动蛋白的表达。 结果：心肌成纤维细胞在体外生长、增殖良好，生长迅速。在倒置显微镜下，心肌成纤维细胞呈类梭形、三角形或多边形，细胞核较大，呈椭圆形，无自发搏动。24h细胞体积增大，呈三角形、梭型或多边形；72h即呈融合状态。免疫细胞化学方法检测分离培养的心肌成纤维细胞纤维连接蛋白、波形蛋白呈阳性，而平滑肌激动蛋白呈阴性。 结论：胰酶消化、反复差速贴壁法是一种合适的心肌成纤维细胞分离培养方法。 第二节阳离子脂质体介导的AP-1 decoy ODNs转染体外培养的心肌成纤维细胞的效率观察 　　目的：确定阳离子脂质体Lipfectamine 2000介导AP-1 decoy ODNs转染体外培养CFs的最佳效率。 方法：人工合成AP-1 decoy ODNs，并经全程硫代磷酸化修饰及FAM荧光素标记。通过脂质体AP-1 decoy ODNs转染体外培养的CFs细胞，应用荧光显微镜观察decoy ODNs在CFs内分布，通过流式细胞仪观察decoy ODNs的最佳转染效率。 结果：AP-1 decoy ODNs可通过脂质体转染CFs细胞后，呈团状分布于胞浆和胞核，且较多的分布在细胞核中，而无脂质体介导的AP-1 decoy ODN几乎未见进入CFs内，但大多分散在细胞胞浆内。通过流式分析发现，在转染12h时，AP-1decoy ODNs/脂质体(g/L)在1：1转染效率为50.58％，在1：2时转染效率为76.14％，在1：3时，达到最大(89.07％)，而1：4时不再增加(87.30％)；在转染12h时，AP-1 decoy ODNs/脂质体(g/L)在1：1荧光强度为258.32，在1：2时荧光强度为419.89，在1：3时，达到最大572.54，而1：4时无明显增加567.23。 结论：Lipfectamine 2000可有效地将AP-1 decoy ODNs转染入CFs细胞内，本实验中decoy ODNs/脂质体最佳的比为1：3。 第三节 AP-1 decoy ODNs对Ang Ⅱ诱导的CFs增殖及胶原合成的影响 　　目的：探讨AP-1 decoy ODNs对Ang Ⅱ引起的CFs增殖、胶原合成及基因的影响，以期为心脏纤维化基因治疗提供理论依据。 方法：通过2.5％胰酶分离培养新生SD大鼠心脏成纤维细胞，采用四氮唑盐(MTT)比色法测定细胞数目，羟脯氨酸比色法测定培养细胞上清胶原合成，分别观察不同浓度的AP-1 decoy ODNs对10-7mmol/L AngⅡ诱导的CFs增殖，胶原的合成的影响，利用流式细胞仪观察Ang Ⅱ及decoy ODNs对CFs周期的影响。采用RT-PCR来检测10-7mmol/L Ang Ⅱ及AP-1 decoy ODNs对CFs Ⅰ型、Ⅲ型基因表达。 结果：AngⅡ能刺激CFs的增殖及胶原的合成量增加(与对照组相比P＜0.05)，而AP-1 decoy ODNs可剂量依赖性的抑制Ang Ⅱ诱导的CFs的增殖及胶原的合成，使细胞停滞在G0/G1期；同时AP-1 decoy ODNs可剂量依赖性抑制Ang Ⅱ诱导CFs Ⅰ型及Ⅲ型基因表达上调作用，其中100nM、200nM组与AngⅡ组比，有显著性意义，而突变的AP-1 decoy无此作用。结论：AP-1 decoy ODNs对Ang Ⅱ诱导CFs增殖及胶原的合成有抑制效应，在心脏纤维化防治中发挥重要的作用。 第三部分 AP-1 decoy ODNs对氧化应激诱导的CFs增殖及MMPs合成的影响 　　目的：探讨AP-1 decoy ODNs对氧化应激下CFs增殖及分泌MMPs的影响，为心室重构的防治提供理论依据。 方法：应用EMSA检测XXO(黄嘌呤+黄嘌岭氧化酶)诱导的CFs AP-1活性变化及转染AP-1 decoy ODNs后对其影响，采用四氮唑盐(MTT)比色法测定细胞数目，观察XXO及转染AP-1 decoy ODNs后对CFs增殖影响。通过Real-time PCR和western blot检测XXO及转染不同浓度的AP-1 decoy ODNs对CFs表达MMP-2、MMP-9、MMP-13基因及蛋白表达影响，结果：在正常培养条件，CFs细胞核内有AP-1蛋白表达，但活性较低。XXO可呈剂量依赖性的方式使AP-1 DNA结合活性增加，转染AP-1 decoy ODNs后，可以抑制这种作用。与对照组相比，OD490在XXO(0.001-0.1mU/mL)诱导下能够剂量依赖性增加，而100nM、200nM decoy ODNs能够显著性抑制这种作用。Real-time PCR及western blot检测CFs表达MMP-2、MMP-9、MMP-13受XXO刺激呈剂量依赖性增加，AP-1 decoy ODNs能够抑制MMP-9和MMP-13表达，而对MMP-2表达没有影响。突变的AP-1 decoy ODNs对CFs的增殖及MMPs均没有影响。 结论：氧化应激能引起CFs中AP-1明显活化，在CFs增殖和MMPs表达中发挥重要的作用，AP-1 decoy ODNs通过竞争性结合活化的AP-1，能够抑制氧化应激引起的CFs增殖及分泌MMPs，为心室重构防治提供了新的策略。 本研究主要结论： 1.人急性心肌梗死周边区MMPs及AP-1表达水平明显升高，AP-1转录激活及MMPs表达增加在心肌梗死心室重构中发挥重要的作用。 2.胰酶消化、差速贴壁法是一种合适的心肌成纤维细胞分离培养方法，脂质体可有效地将AP-1 decoy ODNs转染入CFs细胞内，其最佳比例为1：3。 3.AP-1 decoy ODNs对Ang Ⅱ诱导CFs增殖及胶原的合成有抑制效应，在心脏纤维化防治中发挥重要的作用。 4.氧化应激能引起CFs中AP-1明显活化，在CFs增殖和MMPs表达中发挥重要的作用，AP-1 decoy ODNs通过竞争性结合活化的AP-1，能够抑制氧化应激引起的CFs增殖及分泌MMPs，为心室重构防治提供了新的策略。