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目的
非典型抗精神分裂症药物奥氮平在临床上广泛运用,近年来越来越多研究发现奥氮平引起以肥胖和胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)为主的代谢综合症,显著增加2型糖尿病和心血管疾病患病的风险,降低患者的用药依从性和生活质量。本研究拟建立奥氮平诱导的IR大鼠模型,通过iTRAQ技术筛选奥氮平诱导IR的生物标志物,并进一步探究奥氮平诱导IR的机制。
方法
(1)40只雌性SD大鼠按体重随机分成两组:奥氮平(OLZ)组和空白(BL)组,每组20只,连续8周分别灌胃奥氮平溶液(1.5mg/kg)和空白溶剂。每周固定时间称量大鼠体重,第2、5、7、8周固定时间断尾取血测定大鼠的空腹血糖、空腹胰岛素并计算胰岛素抵抗指数,第八周建模结束后进行口服葡萄糖耐量试验。
(2)分别取不同组大鼠白色脂肪组织样本通过iTRAQ技术进行蛋白组学探究,对差异表达蛋白进行生物学功能注释,GO富集分析、KEGG分析和相互作用分析,Western Blot法验证MYH1、MYL2、Cp、FABP4、apoA-Ⅳ和14-3-3ζ/δ六种差异蛋白的表达。
(3)用FABP4抑制剂BMS309403和apoA-Ⅳ重组质粒分别转染3T3-L1脂肪细胞,GOD-POD法检测奥氮平,BMS309403和apoA-Ⅳ过表达质粒分别干预对细胞胰岛素刺激的葡萄糖吸收的影响,Western Blot法测定各组细胞中总GLUT4、细胞膜GLUT4、p-IRS-1和p-Akt蛋白的表达水平。
结果
(1)大鼠体重、空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗指数均表现为:OLZ组>BL组(P<0.05),口服葡萄糖耐量试验结果显示OLZ组大鼠的葡萄糖耐量严重受损,表明本研究成功建立奥氮平诱导的IR大鼠模型。
(2)蛋白组学鉴定到了270个差异表达蛋白质,GO富集分析发现这些蛋白主要分布于细胞区室,细胞器和含蛋白质的复合物;分子功能分析结果显示位于前三位的功能分别是蛋白质结合,催化活性和分子功能调节剂;生物过程分析结果显示位于前三位的分别是细胞过程,生物调节和代谢过程。KEGG分析结果显示位于前三位的通路途径分别是补体和凝血级联(p<0.01),脂肪消化和吸收(p≤0.01)以及致心律失常性右心室心肌病(p≤0.01)。蛋白质相互作用网络图显示270个差异蛋白之间相互作用,联系密切。Western Blot的验证结果显示奥氮平组中MYH1、MYL2、FABP4和Ywhaz的表达水平均显著升高,Cp和apoA-Ⅳ的表达显著下降,与蛋白组学结果一致。
(3)5μM奥氮平干预3T3-L1脂肪细胞48h显著抑制胰岛素刺激的葡萄糖吸收,升高FABP4的表达,降低apoA-Ⅳ的表达,诱导IRS-1丝氨酸磷酸化,抑制Akt磷酸化和GLUT4的膜易位;BMS309403可减轻奥氮平对葡萄糖吸收的抑制作用,显著降低IRS-1丝氨酸磷酸化,促进Akt磷酸化和GLUT4膜易位;apoA-Ⅳ过表达质粒可缓解奥氮平对葡萄糖吸收的抑制作用,显著降低IRS-1丝氨酸磷酸化,促进Akt磷酸化和GLUT4膜易位。
结论
本研究首次运用iTRAQ技术筛选奥氮平诱导IR的差异表达低丰度蛋白,为寻找奥氮平诱导IR的生物标志物提供了更多的可能性。MYH1、MYL2、Cp、FABP4、apoA-Ⅳ和14-3-3ζ/δ六种蛋白是通过多种方式筛选出的关键蛋白质,可以作为生物标志物的候选。其中,FABP4和apoA-Ⅳ可能是关键的潜在生物标志物,细胞实验提示FABP4和apoA-Ⅳ均通过IRS-1/AKT通路作用于奥氮平诱导的IR。
非典型抗精神分裂症药物奥氮平在临床上广泛运用,近年来越来越多研究发现奥氮平引起以肥胖和胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)为主的代谢综合症,显著增加2型糖尿病和心血管疾病患病的风险,降低患者的用药依从性和生活质量。本研究拟建立奥氮平诱导的IR大鼠模型,通过iTRAQ技术筛选奥氮平诱导IR的生物标志物,并进一步探究奥氮平诱导IR的机制。
方法
(1)40只雌性SD大鼠按体重随机分成两组:奥氮平(OLZ)组和空白(BL)组,每组20只,连续8周分别灌胃奥氮平溶液(1.5mg/kg)和空白溶剂。每周固定时间称量大鼠体重,第2、5、7、8周固定时间断尾取血测定大鼠的空腹血糖、空腹胰岛素并计算胰岛素抵抗指数,第八周建模结束后进行口服葡萄糖耐量试验。
(2)分别取不同组大鼠白色脂肪组织样本通过iTRAQ技术进行蛋白组学探究,对差异表达蛋白进行生物学功能注释,GO富集分析、KEGG分析和相互作用分析,Western Blot法验证MYH1、MYL2、Cp、FABP4、apoA-Ⅳ和14-3-3ζ/δ六种差异蛋白的表达。
(3)用FABP4抑制剂BMS309403和apoA-Ⅳ重组质粒分别转染3T3-L1脂肪细胞,GOD-POD法检测奥氮平,BMS309403和apoA-Ⅳ过表达质粒分别干预对细胞胰岛素刺激的葡萄糖吸收的影响,Western Blot法测定各组细胞中总GLUT4、细胞膜GLUT4、p-IRS-1和p-Akt蛋白的表达水平。
结果
(1)大鼠体重、空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗指数均表现为:OLZ组>BL组(P<0.05),口服葡萄糖耐量试验结果显示OLZ组大鼠的葡萄糖耐量严重受损,表明本研究成功建立奥氮平诱导的IR大鼠模型。
(2)蛋白组学鉴定到了270个差异表达蛋白质,GO富集分析发现这些蛋白主要分布于细胞区室,细胞器和含蛋白质的复合物;分子功能分析结果显示位于前三位的功能分别是蛋白质结合,催化活性和分子功能调节剂;生物过程分析结果显示位于前三位的分别是细胞过程,生物调节和代谢过程。KEGG分析结果显示位于前三位的通路途径分别是补体和凝血级联(p<0.01),脂肪消化和吸收(p≤0.01)以及致心律失常性右心室心肌病(p≤0.01)。蛋白质相互作用网络图显示270个差异蛋白之间相互作用,联系密切。Western Blot的验证结果显示奥氮平组中MYH1、MYL2、FABP4和Ywhaz的表达水平均显著升高,Cp和apoA-Ⅳ的表达显著下降,与蛋白组学结果一致。
(3)5μM奥氮平干预3T3-L1脂肪细胞48h显著抑制胰岛素刺激的葡萄糖吸收,升高FABP4的表达,降低apoA-Ⅳ的表达,诱导IRS-1丝氨酸磷酸化,抑制Akt磷酸化和GLUT4的膜易位;BMS309403可减轻奥氮平对葡萄糖吸收的抑制作用,显著降低IRS-1丝氨酸磷酸化,促进Akt磷酸化和GLUT4膜易位;apoA-Ⅳ过表达质粒可缓解奥氮平对葡萄糖吸收的抑制作用,显著降低IRS-1丝氨酸磷酸化,促进Akt磷酸化和GLUT4膜易位。
结论
本研究首次运用iTRAQ技术筛选奥氮平诱导IR的差异表达低丰度蛋白,为寻找奥氮平诱导IR的生物标志物提供了更多的可能性。MYH1、MYL2、Cp、FABP4、apoA-Ⅳ和14-3-3ζ/δ六种蛋白是通过多种方式筛选出的关键蛋白质,可以作为生物标志物的候选。其中,FABP4和apoA-Ⅳ可能是关键的潜在生物标志物,细胞实验提示FABP4和apoA-Ⅳ均通过IRS-1/AKT通路作用于奥氮平诱导的IR。