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周围神经损伤后缺损的修复是创伤领域的一个难题。自体神经移植修复是目前通常采用的方法,但可能会造成患者新的损伤和功能障碍,而人工神经导管修复周围神经缺损是一种新的治疗方法,属于组织工程范畴,即通过在聚合物支架中植入细胞来探索组织或器官缺损的修复与重建。目前人工神经导管桥接缺损周围神经正处于研究实验阶段,寻找性能理想的材料,且添加适当的神经营养物质,以促进神经功能的恢复程度和速度,进一步探索长间歇缺损神经的再生修复方法仍是研究的热点。
本文以具有较高生物活性、优良生物相容性的胶原为主要原料,通过添加壳聚糖,用自行设计冷冻干燥-蒸汽挤压成型方法,制备下多孔复合胶原支架,然后利用等离子体(Plasma)技术在其表面修饰固定睫状神经营养因子(CNTF),以探索(桥)接大动物较长距离神经缺损的修复效果。用傅立叶-红外光谱仪(FTIR)、(显)示扫描量热(DSC)分析仪和扫描电镜(SEM),分析并观察了支架的微观结构:用改进的单轴拉伸仪器,设计制作压缩测试仪和扭转仪等仪器,模拟体内环境,在体外分析了管状复合胶原支架在运动过程中的拉伸、弯曲、扭转时的受力,进而建立了管状生物支架的力学受力分析方法:以视网膜色素上皮(RPE)作为种子细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验方法评价了复合胶原材料的生物相容性,并用荧光染色观察了RPE细胞生长状况;在体外对比了降解液中有无胶原酶对样品降解损耗率的影响,并分析管状复合胶原支架在降解过程中的受力情况。以PP为模板,系统探索等离子体表面修饰条件对PP表面物化特性的影响,进而考察修饰基团含量对PP表面固定CNTF量的影响规律,建立了固体材料表面微量CNTF检测法。然后在复合胶原支架表面上固定CNTF;将人工复合胶原神经导管组织工程化,桥接犬25mm长的坐骨神经缺损,通过一般观察、肌电图测量、组织学切片和图像分析测量再生神经轴突数量密度、轴突直径、髓鞘厚度等方面评价修复效果。
结果表明:
⑴把神经导管设计成波纹结构能提高支架材料的抗塌陷性和径向挠曲性。
⑵戊二醛(GTA)交联和添加壳聚糖时,使胶原材料发生了交联,且热稳定性得到提高,胶原的三股螺旋结构未被破坏;交联后复合胶原支架表面呈网状,结构致密,且形成了三维网络结构,所制备的导管的管壁上的孔洞变为不对称结构,外层孔的尺寸为几个微米,内层孔的尺寸为几十微米。
⑶胶原酶能促进复合胶原支架的降解速度。
⑷在掌握Ⅰ型胶原特性和其复合胶原溶胀液流变性的基础上,优选了冷冻干燥-蒸汽挤压成型方法所制备的复合胶原支架的改性工艺条件。
延长GTA交联时间,复合胶原支架的孔隙率随之降低,但胶原/壳聚糖质量比的改变对孔隙率的影响较小,孔隙率在50%~80%范围内可控;支架材料的吸水性不仅与材料的亲水性有关,还与支架的三维网络的保持性有关,随着复合材料中壳聚糖含量的增多和GTA交联时间的延长,吸水率降低,支架材料的吸水率在100%左右可控;力学性能实验结果表明,复合材料中壳聚糖含量较少时材料软而韧,随着壳聚糖含量的提高材料将变得硬而强,且使管状材料的抗压性能、抗疲劳性和抗扭刚度得到了有效的提高;延长GTA交联时间,可提高管状材料的抗压性能和弹性恢复率,但首状材料的抗疲劳性降低。MTT比色实验方法表明,各种复合胶原材料对RPE细胞的粘附和增殖具有促进作用。在胶原中加入壳聚糖后,RPE细胞在复合材料上的生长发育并未受到明显影响。荧光染色观察表明,种植在复合胶原支架上的细胞生长状况优于对照组,且72h细胞生长情况比24h的细胞生长旺盛。通过改变胶原和壳聚糖质量比,能够解决神经再生(用)胶原支架在提高物理性能的同时降低生物相容性的问题。
⑸将导管的内径由3.2mm变为5.4mm时,导管材料的拉伸性能基本不变:材料的抗塌陷性和抗疲劳性下降。且在降解过程中,大内径材料较小内径的径向力学性能差。
⑹Plasma处理时间、功率、接枝温度、引发剂浓度对PP表面羧基的接枝率都有明显影响,Plasma处理能有效的改善材料亲水性;Plasma表面修饰后能有效地把CNTF固定于PP材料表面,且PP膜表面接枝的羧酸量越多,PP膜表面固定的CNTF的量越多。
⑺Plasma处理后的复合胶原膜有利于RPE细胞的粘附和增殖,对细胞具有促进作用;Plasma修饰后的聚合物表面与CNTF进行了化学键结合,修饰后的支架材料对神经细胞的粘附和增殖具有促进作用。
⑻用于桥接犬25mm的神经缺损,术后12周,实验组各项检测指标表明:固定有CNTF的复合胶原管组对犬25mm的神经缺损桥架效果好于复合胶原管组,但不如自体神经移植组。说明固定有CNTF的复合胶原神经导管具有良好的生物相容性,将其作为支架能有利于神经再生利桥接缺损神经,在修复神经缺损方面具有良好的应用前景。